cDNA 法推断蛋白质的一级结构实验
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简介
蛋白质和多肽是由 20 种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长链。再通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠卷曲形成一定构象而产生其特异性的活性作用。蛋白质的一级结构即氨基酸的排列顺序，决定了蛋白质的高级结构及功能。因此。测定蛋白质的一级结构是进行蛋白质结构与功能研究中不可缺少的部分。随着研究方法和手段的更新，蛋白质一级结构的分析向提高灵敏度、缩短周期的方向发展。
来源：《蛋白质技术手册》
<link />来源：丁香实验
操作方法
1. 蛋白质样品的准备进行序列分析的蛋白质样品，一般纯度要求大于 95％， 通常是用色谱和电泳精制过的。1.1 SDS-PAGE 纯化的样品从 SDS-PAGE 上分离的蛋白质必须经过特殊处理，使 SDS 浓度低于 0.0005％，否则 SDS 会影响到胰蛋白酶的酶解，也会明显降低 HPLC 分离时的分辨力。在 SDS-PAGE 后，采用电印迹 （bloting） 转移到 PVDF 膜上是常用的方
二、引物的设计在得到蛋白质部分氨基酸序列的基础上通常采用设计简并性或偏性引物，用锚定 PCR 的方法来获得该蛋白质的 cDNA 部分或全长序列。现在许多公司推出的 RACE（rapidly amplication cDNA ends）系统的技术核心便是如此。简并性引物的设计一般遵循以下几个原则：1. 具有高度特异性：根据所得到蛋白质的部分氨基酸序对，在数据库内进行检索，找出较为特异的一段作为设计引物的模板。在互
三、用 PCR 扩增目的 cDNA 片段1. 方法的选择：对于两端序列已知的情况，可根据两端序列设计引物，选用普通的 PCR 方法。对于只知道一端序列的情况，可使用（rapidly amplication cDNA ends）技术，RACE 分为 3' 和 5' 两种（Gibco 公司），也有两端 N 时逬行扩增的 RACE（Clontech 公司）。2. PCR 扩增的模板：PCR 扩增的模板通常是指由 mRNA 逆转录而来 cDNA
四、cDNA 的克隆及测序1. cDNA 片段与载体进行联接反应（多在 4℃下进行低温联接）；2. 使用两次 CaCl2 沉淀法制成的感受态细菌（如 DH5a 或 Jm 109 等菌株），进行转化；3. 结合载体抗生素抗性特点，进行菌落的蓝白斑筛选；4. 单个菌落的扩增培养及质粒的提取，酶切鉴定；5. 阳性质粒的纯化及序列测定；6. cDNA 序列的测定：现在多使用核酸自动测序仪来进行序列的测定。使用仪器多为 PE 公司
五、cDNA 序列的分析及蛋白质一级结构的确定1. 首先是对所得 cDNA 进行同源性的比较。通常是在 NCBl 的 GenBank 数据库中来完成，利用 Blast 程序，比较其与已知基因的同源性。2. 判断是否为完整的 cDNA 序列：如有无 polyA，有无起始和终止密码寻找开放性阅读框架（ORF，open reading frame）等。3. 在上述分析完成后，我们便可以根据已确定的阅读框架将核苷酸序列翻译成氨基酸序列。现在各种工具软
