二、引物的设计

在得到蛋白质部分氨基酸序列的基础上通常采用设计简并性或偏性引物，用锚定 PCR 的方法来获得该蛋白质的 cDNA 部分或全长序列。现在许多公司推出的 RACE（rapidly amplication cDNA ends）系统的技术核心便是如此。

简并性引物的设计一般遵循以下几个原则：

1. 具有高度特异性：根据所得到蛋白质的部分氨基酸序对，在数据库内进行检索，找出较为特异的一段作为设计引物的模板。在互联网上常用的数据库如：GenBank 的 PDB（protein data base），SwissProt 等。

2. 简并度是指每一个位置上碱基数的乘积。一般认为一条简并性引物的简并度不应大于 100。

3. 降低引物的简并度：可以用「I（次黄嘌呤碱基）」来代替，因为理论上 I 可以与任何－种碱基配对。但 I 一般应尽量远离引物的 3' 端。而且如果 3' 末端出现简并性的碱基，则应包括所有可能的碱基，因为 3' 末端碱基的错配会导致 Taq 酶作用延伸反应不能进行。还有一种降低引物简并度的方法是在扩增人的基因时，可以根据偏性密码子来代替高度简并的碱基位置，即猜测（guessmer）。

4. 其他则应遵循非简并性引物的设计要求：引物长度为 19～24 个碱基，G＋C 的含量应在 40％～60％ 之间，3' 末端的碱基最好为 G 或 C，而不要是 A、T 或 I，引物序列中应避免出现重复的互补结构等。

现在设计引物的程序及软件繁多。常用的如：Oligo 5.0、Primer2.0 等。都可以帮助快速有效的进行引物设计。简并性碱基的代表符号见表。

简并性碱基的代表符号