四、cDNA 的克隆及测序

1. cDNA 片段与载体进行联接反应（多在 4℃下进行低温联接）；

2. 使用两次 CaCl₂ 沉淀法制成的感受态细菌（如 DH5a 或 Jm 109 等菌株），进行转化；

3. 结合载体抗生素抗性特点，进行菌落的蓝白斑筛选；

4. 单个菌落的扩增培养及质粒的提取，酶切鉴定；

5. 阳性质粒的纯化及序列测定；

6. cDNA 序列的测定：现在多使用核酸自动测序仪来进行序列的测定。使用仪器多为 PE 公司的 337 型自动测序仪。这种仪器一个反应可以读出约 700 bp 长的核酸序列，正确率在 90％ 以上， 一个反应的成本约在 100 元（人民币）左右。由专业人员进行的测序一般可以保证正确率达到 95％ 以但要完全正确的读出序列。则需通读双链，并进行技术性分析及纠错才可得到。一般认为，在技术完善的情况下，影响测序的因素主要适 cDNA 本身的结构，如 G 和 C 含量过高，序列的一端有 polyT 结构等。