测序（3'端测序，5'端测序）

问：刚做克隆，遇见测序过程中 有3'端测序，5'端测序，到底是怎么回事？为什么有两个测序结果？我应该按那一个来看测序正确还是不正确？

答：测序都是从5'端进行的，正向和反向测序是指对DNA的两条互补链分别测序，通常两个方向测序结果经校读后完全一致才能认为得到可靠结果。一点测序经验：

1、测序选择引物很重要，一般的克隆载体现在都有通用引物，如T7,SP6,M13-47, RVM, ....但选择哪个引物测序呢？我们实验室经常测序，实践证明，引物在载体中所在位置最好是目的片段起始点上游100bp左右，如pGEM-T载体，若测正向的（5'端引物），可用T7，也可用M13-47，但用T7（距插入位点50多），经常出现目的序列前几十bp测不到的现象，用m13-47更好些，虽然会多测些载体。（这是因为，引物之后的几十bp是测不到的，双脱氧末端终止法）。

2、测序结果的校读：如果是让公司测序，自己有目的序列，测验证序目的是验证时，可根据峰图校正（公司一般不做这个工作）。

3、如果自己测序，我们用的是ABI的3100-Advant，测序体系十分重要，BigDye可稀释用，但Buffer必须做相应的补充。引物终浓度0.15uM挺好的，好像是比普通PCR低了一些。质粒(或PCR产物)浓度和纯度至关重要!!质粒最好用试剂盒提，浓度保持在这样的水平：我们20ul体系，里保证有100-300ng。

问：测序报告单来了，烦恼也来了：怎么看才知道有OVERLAP了？我都看晕了。另外：5‘短测序的结果是不是和我要的目的基因互补？即和上游引物序列一致？

答：用专门的序列分析软件，如sequencher、DNAstar等一连就知道了，如果已经overlap的话，结果应该是3‘端测序的末端应该是和5’端测序的末端配对的（配对的多少看你所测一个反应的长度）。第二个问题，5‘端测序结果应该是和上游引物序列一致的，但你的上游引物序列一般在5’端测序结果里是看不到的，就算看到的话也只能看到少数的几个碱基。