循环测序法

与直接测序法相比较，循环测序法有如下优点：所需的模板 DNA 量少；在高温下进行，可使 DNA 聚合酶催化的聚合反应能够通过模板二级结构的区域；多轮的变性步骤便于对质粒 DNA、ADNA、黏粒 DNA 和 PCR 产物等双链 DNA 模板进行测定，不需要经过一个单独的变性步骤而直接进行测序。

循环测序法的基本原理是利用热循环仪高效的自动循环能力，使链终止的序列产物以线性方式获得扩增，从而产生高显影度的序列梯度。首先将 PCR 扩增的 DNA 经变性形成单链形式，使标记引物（³²P、生物素或荧光标记）与其中的一条链上的互补序列退火。退火后的引物在耐热 DNA 聚合酶催化下发生链延伸-终止反应。

由此产生的模板链与延伸终止链形成的部分双链产物在下一轮测序循环中，再次被变性，释放出模板链，作为又一轮引发反应的模板，同时积累下每轮循环产生的链终止产物。这种循环步骤重复 20 ~ 40 次，使链终止产物以线性方式扩增。

器材：

① PCR 仪；

② 电泳仪等。

试剂：

① 模板 可用 PCR 扩增好的 DNA 作模板，也可使用低浓度的 dNTP（10 ~ 20 μmol/L）和引物（1 mmol/L）来进行靶 DNA 的 PCR 扩增，然后直接用 PCR 产物作为模板。DNA 模板浓度：0.01 mmol/L。

质粒 DNA 模板用质粒纯化试剂盒提取。对于高拷贝数的质粒可以直接从菌落中获得测序。测序反应的质粒典型用量：50 ~ 200 mol。

其它模板（M13、黏粒及入 DNA）的制备为常规分子生物学手段。M13 和人 DNA 作为模板用量：10 ~ 100 mol。黏粒 DNA 作为模板用量：50 ~ 200 mol。

② 测序引物。同位素标记测序引物：用 ［γ-³²P］ATP 或 ［γ-³³P］ATP 和 T4 多聚核苷酸激酶对引物的 5' 末端进行同位素标记。引物浓度：0.1 - 0.2 mmol/L。

非同位素标记测序引物：用荧光标记 4 种双脱氧核苷酸，可以进行以荧光为基础的双脱氧测序反应。

③ DNA 聚合酶。应为无 3'f5' 外切活性的耐热 DNA 聚合酶。如 Taq DNA 聚合酶。

④ 测序反应缓冲液根据所用的聚合酶具体而定。

⑤ 放射性标记的 dNTP 根据所用的聚合酶具体而定。

循环测序法的基本过程可分为如下几步：

A 标记引物。取 10 ~ 15 pmol 测序引物、50 μCi 的 ［γ-³²P］ATP、5 μL 10X 激酶缓冲液（商品厂家提供），加水至反应体系 50 μL，混匀后 37 ℃ 预热 5 min。

加入 1 国现稀释的 T4 多聚核苷酸激酶（10 U）, 37 ℃ 孵育 30 min；再加入 10 U 的 T4 多聚核 昔酸激酶，37 ℃ 继续孵育 30 min。

通过凝胶过滤柱除去未掺入的：［γ-³²P］ATP，

标记好的引物可在 - 70 ℃ 保存 2 周以上。

B 制备 dNTP/ddNTP 混合物在 4 个微量离心管中各加入一种 dNTP/ddNTP 混合物 2 μL。

C 制备反应混合物 取相应的 DNA 模板、标记的测序引物 1 ~ 2 pmol、3 μL 的 10X 测序反应缓冲液、5 U 的 Taq DNA 聚合酶，加水至总体积 20 μL，混匀。在该混合物中加入某些试剂， 如 DMSO、Triton X-100、吐温-20 或 NP-40 等，彻底混合均匀，可以提高序列梯度的质量。

D 循环反应 分别取反应混合物 4 μL 加入 4 管 dNTP/ddNTP 混合物中，然后置于 94 °C 的 热循环仪上进行循环反应。每次循环包括：94 °C 变性 1 min、40 ~ 60 °C 退火 30 s 和 72 °C 链延伸-终止 30 s。循环次数：20 ~ 40 次。

E 终止反应体系。循环结束后，在各管中加入 4 μL 终止液（95% 甲酰胺，20 mmol/L ED-TA，0.05% 漠酚蓝，0. 05% 二甲苯腊蓝 FF）, 混匀。样品可在 - 70 °C 保存 2 ~ 7 d。 电泳前在电热仪上 80 °C 加热 3 min。

F 电泳分离和序列判读 每一泳道上样 2 ~ 3 μL，电泳。釆用放射自显影方法进行序列判读；³²P 标记的需要过夜曝光显影，若用 ³²P 标记的需要 2 ~ 3 d 曝光显影。

1 在标记引物过程中，为获得高比活的标记引物，反应体系中引物、激酶及 ［y-³²P］ ATP 要保持在一个最佳水平。

2 确定最佳 dNTP/ddNTP 比例非常关键，应采用产生低本底、高显影度的序列梯度所需要的最佳 dNTP/ddNTP 比例。

3 为了提高靠近引物（1-100 个碱基范围内）的序列梯度的自显影强度，可以向测序反应体系中加入 Mn²⁺，提高 DNA 聚合酶对掺入 ddTNP 的效率。而当为了提高远离引物（200 ~ 400 个碱基范围内）的序列梯带的自显影强度，则需要提高链延伸-终止反应混合液中 dNTP 的含量，具体依所用聚合酶而定。