新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）
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新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔 来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，因而可以在此基础上使用多种方 法来进行高通量检测。此外，纳米级别的孔径保证了检测具有良好的持续性，所以测序的准确度非常高。对 于长达1,000个碱基的单链DNA分子、RNA分子或者更短的核酸分子而言，根本无需进行扩增或标记就可以 使用纳米孔测序法进行检测，这使得便宜、快速地进行DNA测序成为可能。如果对现有纳米孔测序法进行进 一步发展和改进，那么它将有望成为第三代测序技术（也可称为下、下一代测序技术），从而帮助人们实现 24小时内只花费1,000美元完成二倍体哺乳动物基因组测序这一目标。
一个盛满电解质溶液的容器被一纳米孔膜隔成两半，如果施以比较小的电压，如约100mV电压，就能 使用标准的电生理检测手段测量通过纳米孔的电流大小。很多生物电通道的开关都是靠小肽段分子是否堵 塞通道来实现的。基于这个事实，加州大学圣克鲁兹分校（University of California Santa Cruz, UCSC）的 Deamer和哈佛大学（Harvard University）的George Church都不约而同地提出一个构想：如果DNA分子 或者RNA分子也能堵塞某个通道，那么应该可以运用上述方法来检测电流。接下来，Deamer和Branton等 人证明了单链DNA和RNA分子能通过蛋白质组成的孔道，并且能检测到它们通过这种纳米级孔道时所造成 的电流改变（图8a）。他们使用的孔道蛋白是金黄色葡萄球菌α溶血素（Staphylococcus aureus toxin， α-hemolysin）。这种蛋白以前曾被Bayley小组用作生物传感器。Bayley小组发现，α溶血素蛋白非常稳 定，即使在接近100℃的情况下也能维持正常的功能。Deamer和Branton等人发现，因为α溶血素蛋白孔径 非常小，简直与单链核苷酸的直径相差无几，所以可以将折叠卷曲的核苷酸链解开，并仅允许它以单链的形 式通过蛋白孔道。单链核苷酸分子穿过蛋白孔道时会造成局部电流改变，即相比没有分子穿过时的电流强度 有所减小。基于这个现象，Deamer和Branton等人猜测，如果核酸分子中每一个核苷酸通过孔道时都能出现 一种特定形式的电流改变，那么通过分析电流改变的情况不就能知道核酸的序列了吗？
为了验证这个想法，Deamer小组、Meller和Branton小组使用好几种不同的RNA分子和单链DNA分子 进行了研究，以观察它们对电流的影响。结果发现，polyC RNA分子引起的电流强度下降比polyA RNA分子 要强得多。此外，他们还发现，由30个A和70个C组成的RNA分子在序列从A转变成C时电流强度也会发生改 变。不过不幸的是，这种嘌呤和嘧啶之间的明显差异没能在脱氧核糖核苷酸试验中发现。实际上，在RNA试 验中观察到的polyA和polyC引起不同形式的电流改变是由碱基堆积（base stacking）和二级结构上的差异 造成的。随后，使用不同DNA同聚物（DNA homopolymer）进行试验发现，脱氧嘌呤寡聚物（deoxypurine oligomer）和脱氧嘧啶寡聚物（deoxypyrimidine oligomer）引起的电流改变差别并不大，只有不足5%。而 且这种电流改变差异是由10~15个核苷酸（占据了α溶血素蛋白的跨膜区）引起的，它无法区别单个核苷酸 引起的电流改变之间的差异（图8a）。
图8 四种纳米孔测序技术示意图。
（a）借助核酸链堵塞纳米孔时引起的电流强度改变来测序。图左侧是典型的电流强度图，从图中可见，纳米孔通 道通畅时（右上图）和被DNA链堵塞时（右下图）的电流强度是有明显区别的，但是无法区分堵塞纳米孔通道的 12bp核苷酸的组成。（b）核酸外切酶测序。图中淡蓝色的核酸外切酶通过深蓝色的接头连接在α溶血素纳米孔的 顶端，外切酶逐个切下DNA链末端的dNMP（金色），然后dNMP进入纳米孔中，通过红色的氨基化环糊精配体， 引起相应的电流改变，从而被检测出来。（c）使用合成DNA和光读取技术测序。待测DNA链中的每一个核苷酸都 被替换成更长的由橙色和蓝色碱基组成的寡聚体，每一个待测核苷酸都被12bp的寡聚体替代。将这种转换后的新 DNA链与分子信标杂交，杂交链在通过纳米孔时分子信标会脱落，释放出荧光，读取这些荧光就可以推测出原始 DNA链的序列。（d）借助横向隧穿电流测序。纳米孔中装载有橙色的电极和黑色的后门，当DNA链通过纳米孔 时，横向的隧穿电流会发生变化，并且每一种核苷酸都有其各自独特的横向电流，因此可以借助这些电流来测序。
一个盛满电解质溶液的容器被一纳米孔膜隔成两半，如果施以比较小的电压，如约100mV电压，就能 使用标准的电生理检测手段测量通过纳米孔的电流大小。很多生物电通道的开关都是靠小肽段分子是否堵 塞通道来实现的。基于这个事实，加州大学圣克鲁兹分校（University of California Santa Cruz, UCSC）的 Deamer和哈佛大学（Harvard University）的George Church都不约而同地提出一个构想：如果DNA分子 或者RNA分子也能堵塞某个通道，那么应该可以运用上述方法来检测电流。接下来，Deamer和Branton等 人证明了单链DNA和RNA分子能通过蛋白质组成的孔道，并且能检测到它们通过这种纳米级孔道时所造成 的电流改变（图8a）。他们使用的孔道蛋白是金黄色葡萄球菌α溶血素（Staphylococcus aureus toxin， α-hemolysin）。这种蛋白以前曾被Bayley小组用作生物传感器。Bayley小组发现，α溶血素蛋白非常稳 定，即使在接近100℃的情况下也能维持正常的功能。Deamer和Branton等人发现，因为α溶血素蛋白孔径 非常小，简直与单链核苷酸的直径相差无几，所以可以将折叠卷曲的核苷酸链解开，并仅允许它以单链的形 式通过蛋白孔道。单链核苷酸分子穿过蛋白孔道时会造成局部电流改变，即相比没有分子穿过时的电流强度 有所减小。基于这个现象，Deamer和Branton等人猜测，如果核酸分子中每一个核苷酸通过孔道时都能出现 一种特定形式的电流改变，那么通过分析电流改变的情况不就能知道核酸的序列了吗？
为了验证这个想法，Deamer小组、Meller和Branton小组使用好几种不同的RNA分子和单链DNA分子 进行了研究，以观察它们对电流的影响。结果发现，polyC RNA分子引起的电流强度下降比polyA RNA分子 要强得多。此外，他们还发现，由30个A和70个C组成的RNA分子在序列从A转变成C时电流强度也会发生改 变。不过不幸的是，这种嘌呤和嘧啶之间的明显差异没能在脱氧核糖核苷酸试验中发现。实际上，在RNA试 验中观察到的polyA和polyC引起不同形式的电流改变是由碱基堆积（base stacking）和二级结构上的差异 造成的。随后，使用不同DNA同聚物（DNA homopolymer）进行试验发现，脱氧嘌呤寡聚物（deoxypurine oligomer）和脱氧嘧啶寡聚物（deoxypyrimidine oligomer）引起的电流改变差别并不大，只有不足5%。而 且这种电流改变差异是由10~15个核苷酸（占据了α溶血素蛋白的跨膜区）引起的，它无法区别单个核苷酸 引起的电流改变之间的差异（图8a）。
图8 四种纳米孔测序技术示意图。
（a）借助核酸链堵塞纳米孔时引起的电流强度改变来测序。图左侧是典型的电流强度图，从图中可见，纳米孔通 道通畅时（右上图）和被DNA链堵塞时（右下图）的电流强度是有明显区别的，但是无法区分堵塞纳米孔通道的 12bp核苷酸的组成。（b）核酸外切酶测序。图中淡蓝色的核酸外切酶通过深蓝色的接头连接在α溶血素纳米孔的 顶端，外切酶逐个切下DNA链末端的dNMP（金色），然后dNMP进入纳米孔中，通过红色的氨基化环糊精配体， 引起相应的电流改变，从而被检测出来。（c）使用合成DNA和光读取技术测序。待测DNA链中的每一个核苷酸都 被替换成更长的由橙色和蓝色碱基组成的寡聚体，每一个待测核苷酸都被12bp的寡聚体替代。将这种转换后的新 DNA链与分子信标杂交，杂交链在通过纳米孔时分子信标会脱落，释放出荧光，读取这些荧光就可以推测出原始 DNA链的序列。（d）借助横向隧穿电流测序。纳米孔中装载有橙色的电极和黑色的后门，当DNA链通过纳米孔 时，横向的隧穿电流会发生变化，并且每一种核苷酸都有其各自独特的横向电流，因此可以借助这些电流来测序。
