新型纳米孔测序法实现简单快速进行DNA测序

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本文介绍了新型纳米孔测序法这项新技术的优胜之处以及加州大学和哈佛大学研究人员对其猜想验证和实验的过程。

四种纳米孔测序技术示意图

新型纳米孔测序法(nanopore sequencing)是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，因而可以在此基础上使用多种方 法来进行高通量检测。此外，纳米级别的孔径保证了检测具有良好的持续性，所以测序的准确度非常高。对 于长达1,000个碱基的单链DNA分子、RNA分子或者更短的核酸分子而言，根本无需进行扩增或标记就可以 使用纳米孔测序法进行检测，这使得便宜、快速地进行DNA测序成为可能。如果对现有纳米孔测序法进行进 一步发展和改进，那么它将有望成为第三代测序技术(也可称为下、下一代测序技术)，从而帮助人们实现 24小时内只花费1,000美元完成二倍体哺乳动物基因组测序这一目标。

一个盛满电解质溶液的容器被一纳米孔膜隔成两半，如果施以比较小的电压，如约100mV电压，就能 使用标准的电生理检测手段测量通过纳米孔的电流大小。很多生物电通道的开关都是靠小肽段分子是否堵 塞通道来实现的。基于这个事实，加州大学圣克鲁兹分校(University of California Santa Cruz, UCSC)的 Deamer和哈佛大学(Harvard University)的George Church都不约而同地提出一个构想：如果DNA分子 或者RNA分子也能堵塞某个通道，那么应该可以运用上述方法来检测电流。接下来，Deamer和Branton等 人证明了单链DNA和RNA分子能通过蛋白质组成的孔道，并且能检测到它们通过这种纳米级孔道时所造成 的电流改变(图8a)。他们使用的孔道蛋白是金黄色葡萄球菌α溶血素(Staphylococcus aureus toxin， α-hemolysin)。这种蛋白以前曾被Bayley小组用作生物传感器。Bayley小组发现，α溶血素蛋白非常稳 定，即使在接近100℃的情况下也能维持正常的功能。Deamer和Branton等人发现，因为α溶血素蛋白孔径 非常小，简直与单链核苷酸的直径相差无几，所以可以将折叠卷曲的核苷酸链解开，并仅允许它以单链的形 式通过蛋白孔道。单链核苷酸分子穿过蛋白孔道时会造成局部电流改变，即相比没有分子穿过时的电流强度 有所减小。基于这个现象，Deamer和Branton等人猜测，如果核酸分子中每一个核苷酸通过孔道时都能出现 一种特定形式的电流改变，那么通过分析电流改变的情况不就能知道核酸的序列了吗?

为了验证这个想法，Deamer小组、Meller和Branton小组使用好几种不同的RNA分子和单链DNA分子 进行了研究，以观察它们对电流的影响。结果发现，polyC RNA分子引起的电流强度下降比polyA RNA分子 要强得多。此外，他们还发现，由30个A和70个C组成的RNA分子在序列从A转变成C时电流强度也会发生改 变。不过不幸的是，这种嘌呤和嘧啶之间的明显差异没能在脱氧核糖核苷酸试验中发现。实际上，在RNA试 验中观察到的polyA和polyC引起不同形式的电流改变是由碱基堆积(base stacking)和二级结构上的差异 造成的。随后，使用不同DNA同聚物(DNA homopolymer)进行试验发现，脱氧嘌呤寡聚物(deoxypurine oligomer)和脱氧嘧啶寡聚物(deoxypyrimidine oligomer)引起的电流改变差别并不大，只有不足5%。而 且这种电流改变差异是由10~15个核苷酸(占据了α溶血素蛋白的跨膜区)引起的，它无法区别单个核苷酸 引起的电流改变之间的差异(图a)。

(a)借助核酸链堵塞纳米孔时引起的电流强度改变来测序。图左侧是典型的电流强度图，从图中可见，纳米孔通 道通畅时(右上图)和被DNA链堵塞时(右下图)的电流强度是有明显区别的，但是无法区分堵塞纳米孔通道的 12bp核苷酸的组成。(b)核酸外切酶测序。图中淡蓝色的核酸外切酶通过深蓝色的接头连接在α溶血素纳米孔的 顶端，外切酶逐个切下DNA链末端的dNMP(金色)，然后dNMP进入纳米孔中，通过红色的氨基化环糊精配体， 引起相应的电流改变，从而被检测出来。(c)使用合成DNA和光读取技术测序。待测DNA链中的每一个核苷酸都 被替换成更长的由橙色和蓝色碱基组成的寡聚体，每一个待测核苷酸都被12bp的寡聚体替代。将这种转换后的新 DNA链与分子信标杂交，杂交链在通过纳米孔时分子信标会脱落，释放出荧光，读取这些荧光就可以推测出原始 DNA链的序列。(d)借助横向隧穿电流测序。纳米孔中装载有橙色的电极和黑色的后门，当DNA链通过纳米孔 时，横向的隧穿电流会发生变化，并且每一种核苷酸都有其各自独特的横向电流，因此可以借助这些电流来测序。