材料与仪器
TEMED SGM Plus®凝胶上样混合液
ABI377 DNA 测序仪 制胶材料 凝胶装置材料 冰或者电制冷板 热循环仪 凝胶板和凝胶盒 缓冲液梢 热传导板
ABI377 DNA 测序仪 制胶材料 凝胶装置材料 冰或者电制冷板 热循环仪 凝胶板和凝胶盒 缓冲液梢 热传导板
步骤
1. 在烧杯中混合以下各成分，制备 4 % 聚丙烯酰胺凝胶（制胶材料：量筒、天平、过滤器（如 Sartolab 150 ml 滤器），真空泵、梳子、0.2 mm 胶隔板、磁力搅拌器、尿素（如 Fisher）、丙烯酰胺贮存液（如Bio-Rad 40 % 丙烯酰胺/BIS 19：1）、无菌纯水（如 Fisher AR 级水）、混合床基树脂（如 Sigma）、过硫酸铵（如 Sigma）、10× TBE （如 National Diagnostics）、TEMED （如 Sigma））：
(a)尿素 18 g；
(b)40 % 丙烯酰胺贮存液 5.2 ml；
(c)水 27 ml；
(d)混合床基树脂 0.5 g 。
2. 灌胶。
3. 参照技术手册，安装 ABI377 DNA 测序仪，准备跑胶。
4. 从热循环仪中取出样品，制备上样混合物（甲醛、葡聚糖蓝色染料（试剂盒提供）、Gene Scan500（GS500 ROX）内尺寸标准（试剂盒提供）），每管如下：
(a)甲醛 1.2 μl；
(b)GS500 ROX 0.13 μl；
(c)葡聚糖蓝色上样缓冲液 0.2 μl。
5. 吸 1.5 μl 上样混合物，加入适当的管或板中。同时制备 2 个等位梯度（试剂盒提供）的上样混合物。向适当的管或板中加入 PCR 扩增产物或等位梯度，轻轻混合。
6. 加热含 PCR 扩增产物的上样混合物，使 DNA 变性，95°C 约 3 min，立即移入冰浴中或设定在 0°C 的电子冰盒中。
7. 参照 ABI 技术手册，完成 DNA 测序仪的安装，装上凝胶，从单数泳道开始上样。
8. 跑胶需 2.5 h 。
(a)尿素 18 g；
(b)40 % 丙烯酰胺贮存液 5.2 ml；
(c)水 27 ml；
(d)混合床基树脂 0.5 g 。
2. 灌胶。
3. 参照技术手册，安装 ABI377 DNA 测序仪，准备跑胶。
4. 从热循环仪中取出样品，制备上样混合物（甲醛、葡聚糖蓝色染料（试剂盒提供）、Gene Scan500（GS500 ROX）内尺寸标准（试剂盒提供）），每管如下：
(a)甲醛 1.2 μl；
(b)GS500 ROX 0.13 μl；
(c)葡聚糖蓝色上样缓冲液 0.2 μl。
5. 吸 1.5 μl 上样混合物，加入适当的管或板中。同时制备 2 个等位梯度（试剂盒提供）的上样混合物。向适当的管或板中加入 PCR 扩增产物或等位梯度，轻轻混合。
6. 加热含 PCR 扩增产物的上样混合物，使 DNA 变性，95°C 约 3 min，立即移入冰浴中或设定在 0°C 的电子冰盒中。
7. 参照 ABI 技术手册，完成 DNA 测序仪的安装，装上凝胶，从单数泳道开始上样。
8. 跑胶需 2.5 h 。
来源：丁香实验
