原理
用 Qiagen®QIAamp®迷你试剂盒从细胞团提取 DNA；抽提到的 DNA 用SGMPlius®扩增，然后用 ABI377 DNA 测序仪进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，用GeneScan®和Genotyper®软件进行分析。
材料与仪器
Qiagen®DNA迷你试剂盒
无水乙醇 磷酸缓冲液
小离心管 离心机 水浴或可以维持56℃的烤箱 涡流混合器
无水乙醇 磷酸缓冲液
小离心管 离心机 水浴或可以维持56℃的烤箱 涡流混合器
步骤
一、开始实验前，必须准备以下试剂：
(a)蛋白酶溶剂溶解：向 Qiagen® 冷冻干燥的蛋白酶中加适量蛋白酶溶剂。该溶液 2~8°C 保存 2 个月内稳定。
(b)AW 1 和 AW 2 缓冲液：向装有 AW 1 和 AW 2 浓缩液的瓶子中加人适量无水乙醇。AW 1 和 AW 2 缓冲液室温下一年内稳定。
(c)AL 缓冲液：用前颠倒充分混匀。
二、操作步骤
（试剂盒生产商的操作步骤，稍加修改）
如果细胞不是以培养基悬浮的细胞悬液，从步骤 5 进行。
如果收到的是在培养基中的细胞团：
1. 样品 20000 g 离心（离心机，如Eppendorf 5415D 或相似规格） 3 min 。
2. 用细尖移液管，小心移弃上清液。
3 . 以 200 μl PBSA 悬浮细胞。
4. 重复步骤 1、2 一次。
5. 以 200 μl PBSA 悬浮细胞。
6. 将 20 μl Qiagen® 蛋白酶加到标记好的 1.5 ml 空离心管（如 Eppendorf Biopure Safelock tubes）中。
7. 取 200 μl 各样品，加到相应标记的已加蛋白酶的离心管中。
8. 每管中加 200 μl AL 缓冲液（裂解缓冲液）。
9. 样品在 56°C 孵育 30 min 。
10. 每管用涡流混旋器混匀约 15 s。
11. 之后，1000 g 离心 3 s，使管中内容物聚到管底。 .
12. 小心打开每管，加人 200 μl 无水乙醇。
13. 每管用涡流混旋器混匀约 15 s。1000 g 离心 3 s，使管中内容物沉淀。
14. 小心将每管的内容物转移到对应标记的 QIAamp® 旋转柱中，该离心柱已置于收集管中。
15. 抒紧离心柱的盖子，6000 g 转 1 min 。
16. 将旋转柱置于干净的收集管中，弃掉含滤液的管子。
17. 小心打开旋转柱的盖子，加入 500 μl AW1 缓冲液。
18. 重复步骤 15 和 16。
19. 小心打开旋转柱的盖子，加入 500 μl AW2 缓冲液。
20. 拧紧盖子，20000 g 离心 3 min。
21. AW 2 对下游使用有破坏作用，所以建议更换收集管，旋转柱在以 20000 g 转离心 1 min 。确保所有的 AW 2 缓冲液已弃掉。
22. 将柱子放入对应标记的 1.5 ml 离心管中。
23. 打开柱子的盖，加 200 μl AE 缓冲液（洗脱缓冲液）。
24. 56°C 孵育 1 min，然后 6000 g 再离心 1 min 。
25. 每个样品的 DNA 进行定量，如用 Picogreen （Molecular Probes）。
26. 如果不是马上进行扩增，样品应冻存。
(a)蛋白酶溶剂溶解：向 Qiagen® 冷冻干燥的蛋白酶中加适量蛋白酶溶剂。该溶液 2~8°C 保存 2 个月内稳定。
(b)AW 1 和 AW 2 缓冲液：向装有 AW 1 和 AW 2 浓缩液的瓶子中加人适量无水乙醇。AW 1 和 AW 2 缓冲液室温下一年内稳定。
(c)AL 缓冲液：用前颠倒充分混匀。
二、操作步骤
（试剂盒生产商的操作步骤，稍加修改）
如果细胞不是以培养基悬浮的细胞悬液，从步骤 5 进行。
如果收到的是在培养基中的细胞团：
1. 样品 20000 g 离心（离心机，如Eppendorf 5415D 或相似规格） 3 min 。
2. 用细尖移液管，小心移弃上清液。
3 . 以 200 μl PBSA 悬浮细胞。
4. 重复步骤 1、2 一次。
5. 以 200 μl PBSA 悬浮细胞。
6. 将 20 μl Qiagen® 蛋白酶加到标记好的 1.5 ml 空离心管（如 Eppendorf Biopure Safelock tubes）中。
7. 取 200 μl 各样品，加到相应标记的已加蛋白酶的离心管中。
8. 每管中加 200 μl AL 缓冲液（裂解缓冲液）。
9. 样品在 56°C 孵育 30 min 。
10. 每管用涡流混旋器混匀约 15 s。
11. 之后，1000 g 离心 3 s，使管中内容物聚到管底。 .
12. 小心打开每管，加人 200 μl 无水乙醇。
13. 每管用涡流混旋器混匀约 15 s。1000 g 离心 3 s，使管中内容物沉淀。
14. 小心将每管的内容物转移到对应标记的 QIAamp® 旋转柱中，该离心柱已置于收集管中。
15. 抒紧离心柱的盖子，6000 g 转 1 min 。
16. 将旋转柱置于干净的收集管中，弃掉含滤液的管子。
17. 小心打开旋转柱的盖子，加入 500 μl AW1 缓冲液。
18. 重复步骤 15 和 16。
19. 小心打开旋转柱的盖子，加入 500 μl AW2 缓冲液。
20. 拧紧盖子，20000 g 离心 3 min。
21. AW 2 对下游使用有破坏作用，所以建议更换收集管，旋转柱在以 20000 g 转离心 1 min 。确保所有的 AW 2 缓冲液已弃掉。
22. 将柱子放入对应标记的 1.5 ml 离心管中。
23. 打开柱子的盖，加 200 μl AE 缓冲液（洗脱缓冲液）。
24. 56°C 孵育 1 min，然后 6000 g 再离心 1 min 。
25. 每个样品的 DNA 进行定量，如用 Picogreen （Molecular Probes）。
26. 如果不是马上进行扩增，样品应冻存。
来源：丁香实验
