cDNA文库组标准流程四:载体制备

 

1 ． pBlueScriptII 的提取

1．取1ul商品的pBlueScriptII，转化入大肠杆菌宿主菌中，取5ul转化产物均匀涂布在含AMP的LB平板上，37℃培养过夜。

2．第二天取一只无菌的50ml离心管，加入10ml AMP抗性的LB液体培养基，挑单克隆于离心管中，37℃，250rpm，培养过夜。

3．第三天取200µl小摇后的菌液接种于250ml 含AMP的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养6 hr左右，使OD值达到0.6-0.8。

4．将菌液移入250ml离心管中， 4℃，3000rpm，离心15min。取出离心管，菌团朝上倒掉上清，将离心管倒置于吸水纸上使上清充分滤干。（注意离心前需配平）

5．加入10ml溶液Ⅰ（50mM Glucose ， 25mM Tris-HCl，10mM EDTA， pH8．0），加入RNase至终浓度100µg/ml，晃动摇菌，使菌体充分悬浮，静置10min。

6．按NaOH（0.4N）：SDS（2%）--1：1的比例新鲜配制溶液Ⅱ，加入20ml溶液Ⅱ，静置3-5min。

注： 静置时间勿超过5min，提前将溶液Ⅲ置于冰盒中。

7．加入15ml冰浴的溶液Ⅲ，冰浴15-30min。

8．4℃，5000rpm，离心15min。

9．取上清于两个50ml离心管中，弃去原离心管中的沉淀。

10．每管加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀，室温下放置10min。

11. 20℃，12000g，离心20min回收质粒沉淀。

12．弃上清，用70％的乙醇洗2次。

13．弃上清，倒扣于吸水纸上，尽量空干液体。

14．用3ml TE（pH8.0）溶解沉淀，移入1.5ml Eppendorf离心管中。

15．电泳检查DNA质量并定量。（必要的话，可以用胶回收的方法先纯化一下质粒再进行双酶切。）

2 ．pBlueScriptII的双酶切消化

1．以如下体系进行EcoRI酶切：

pBSK(+)                   X µl（6µg）

ddH2O                     174-X µl

10×Buffer E                20 µl

混匀，加入限制性内切酶：

         EcoRI （10U/ µl）            6 µl  

    总体积为200 µl。

2．轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。

3．37℃，水浴1hr。

4．加入200ul 1:1的酚/氯仿，混匀。4℃，13000rpm，离心15min。

5．取上清，加入等体积的氯仿，4℃，13000rpm，离心10min。

6．取上清，加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇，－20℃，沉淀30min。

7. 4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。

8．加入200ul 70％的乙醇洗沉淀。

9．4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。

10．自然风干沉淀，至无乙醇味，加入100ul ddH2O充分溶解沉淀。

11．加入以下试剂进行XhoI酶切：

  ddH2O                   74 µl

10×Buffer D               20 µl

混匀，加入限制性内切酶XhoI：

            XhoI （10U/ µl）         6 µl  

总体积为200 µl。

12.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下

13.37℃，水浴1.5hr。

14．加入200ul 1:1的酚/氯仿，混匀。

15．4℃，13000rpm，离心15min。

16．取上清，加入等体积的氯仿，4℃，13000rpm，离心10min。

17．取上清，加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇，－20℃，沉淀30min。

18. 4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。

19．加入200ul 70％的乙醇洗沉淀。

20．4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。

21．自然风干沉淀至无乙醇味，加入40ulddH2O充分溶解沉淀，得到双酶切载体。

3 ．载体去磷酸化

1．在40ul双酶切载体中加入以下试剂：

              6ul   10×buffer

              6ul     CIAP（0.01U/ul）

              8ul    ddH2O

   总体积60ul。

2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。

3.37℃，水浴1hr。

4．70℃，15min，灭活酶。

5．电泳分离，胶回收双酶切载体，定量。

4 ．载体效率检测

1．按以下所示作4个连接反应：

      

	DNA	连接酶
1	pBlueScriptII/E/X /CIAP	-	检测酶切效率
2	pBlueScriptII/E/X /CIAP	+	检测脱磷效率，载体自连效率
3	商品Vector加标准Insert	+	对照
4	自制Vector加标准Insert	+	检测载体效率

14℃连接过夜。

2．  各取1ul连接产物作电转化（具体流程见电转化）

3．计算克隆数，计算载体相对脱磷效率及连接效率。