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cDNA文库组标准流程

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9281

第一部分 Total RNA 的提取

一、 试剂配制

准备工作:

1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部,置于烤箱内,180℃,烤6小时。

2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后,121℃ 20mins 高压灭菌。

3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。

4、常用试剂及其配方:

▲DEPC水:在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。

▲0.78M柠檬酸纳:PH=4~5

三水合柠檬酸纳 22.94g

加DEPC水定容至100ml,室温放置备用。

▲10%肌氨酸钠:

肌氨酸钠 10g

加DEPC水定容至100ml,室温放置备用。

▲变性裂解液:

0.78M柠檬酸钠 8.25ml

10%肌氨酸钠 12.375ml

异硫氰酸胍 118.05g

加DEPC水定容至 250ml,室温放置备用

临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%(v/v)

▲2M 醋酸钠 PH=4.5

NaAc・3H2O 13.6g

加DEPC水定容至50ml,高压灭菌,室温放置备用

▲3M醋酸钠PH=5

NaAc・3H2 O 20.4g

加DEPC水定容至50ml,高压灭菌,室温放置备用

▲ 4M LiCL:

LiCL 24.164g

加DEPC水定容至100ml,高压灭菌,室温放置备用

▲0.5M EDTA PH=8.0

EDTA 18.61g

用NaOH调PH值至8.0,定容到100ml,高压灭菌,室温放置备用

▲10X MOPS (3-(N-吗啉代)丙磺酸):

MOPS 41.86g

NaAC・3H2O 4.10g

0.5MEDTA(PH 8.0) 20ml

用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L,室温避光放置备用。

▲1x MOPS:

10x MOPS 30ml

加DEPC水270ml,用时现配。

▲4x RNA Loading buffer:

10x MOPS 400ul

甘油(高压过) 200UL

溴酚兰 10ul

甲醛(37%) 72ul

去离子甲酰氨 310ul

EDTA(0.5M PH 8.0) 8ul

ErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul

在4℃ 可保持3个月

▲10x PBS

pH=7.4

NaCl 80g

KCl 2g

Na2HPO4 14.4g

KH2PO4 2.4g

定容至1000ml

▲变性电泳胶:

称取0.5g琼脂糖,加入47.5ml 1x MOPs,加热至琼脂糖熔化后,冷却至50℃左右,加入2.5ml甲醛,轻轻混匀后倒入电泳托上。

▲变性电泳缓冲液:

在250ml容量瓶内加入5ml甲醛,用1x MOPS定容至250ml


二、 动物组织 total RNA 的提取

1.根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量,将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中,冰浴5分钟。

2.将组织样品放入变性裂解液中,在高速下匀浆15-30秒/次,直到看不见组织和细胞碎片。

3.根据表1加入适量2M的乙酸钠(pH4.0),反复颠倒混匀4-5次。

4.根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次,再摇动10秒钟。

5.冰浴10分钟。

6.4°C,12000g离心20分钟。

7.小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,内含所需的RNA。蛋白质和DNA分别留在了有机相和中间层。

8.加入等体积的异丙醇,-20°C沉淀30分钟以上。

9.4°C,12000g离心20分钟。

10.   根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA。

11.   加等体积的氯仿,加盖颠倒混合4-5次,再摇动10秒钟。

12.   4°C,12000g离心20分钟。

13.   小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇,-20°C沉淀至少30分钟。

14.   4°C,12000g离心20分钟。

15.   弃上清,加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀。4°C,12000g离心10分钟。

16.   弃上清,空气中干燥RNA沉淀,直至没有乙醇气味。用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀。

17.   取少量RNA用于测定OD值及电泳,其余置-80°C冰箱中保存。

表 1

Mg# of tissue
500
800
1000
变性裂解液(ml)
5
8
10
2M NaOAC pH 4 (ml)
0.5
0.8
1
水饱和酚 (mL)
5
8
10
氯仿 (mL)
1
1.6
2
异丙醇(mL)
4
6
8
变性裂解液 (mL)
0.5
0.8
1
异丙醇(mL)
0.5
0.8
1
75% 乙醇(mL)
1
1
1
DEPC-treated H2 0 (mL)
0.5
0.8
1

三、植物组织total RNA的提取

1. 先将研钵于-80℃冰箱中预冷,然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状。

2. 将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中,充分匀浆。(1g样品加入3ml变性裂解液)。

3. 加入0.3ml(1/10体积)2M的NaAc(ph4-5)颠倒混匀。

4. 加入3ml(等体积)的水饱和酚,充分振荡,再加入1ml(1/3)的氯仿,振荡。

5. 冰浴10min。4℃,12000g离心10min

6. 小心转移上清于另一离心管中,加入2倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀至少1小时。

7. 4℃,12000g离心20min。

8. 去上清,取沉淀。加1ml 4M的LiCl 溶解沉淀(1mlLiCl/g组织),并转入1.5ml离心管中。

9. 4℃,13000rpm离心15min。

10.  用0.4ml DEPC水溶解沉淀,加1/2体积的水饱和酚,1/2体积的氯仿,颠倒混匀。

11.  4℃,13000rpm离心10min。

12.  取上清,加1/10体积的3MNaAc(ph5)和2倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

13.  4℃,13000rpm离心15min。

14.  弃上清,用1ml 75%的乙醇洗涤沉淀,4℃,13000rpm离心10min。

15.  弃上清,取沉淀,空气中干燥RNA沉淀,直至无乙醇味。

16.  用40-60μl DEPC水溶解(300-500ug/g)RNA沉淀。

17.  取少量RNA用于测定OD值及电泳,其余置-80℃冰箱中保存。


四、 TRIzol Reagent 提取total RNA(GIBCO)

1.查表2根据样品量选择适当的 TRIzol Reagent体积装入50ml RNase-free离心管中,注意样品体积不能超过TRIzol Reagent体积的10%。

2.将组织样品放入TRIzol Reagent中,高速下匀浆15-30秒/次,直至看不见组织和细胞碎片。

3.室温温育10分钟。

4. 据表2加入适量体积的氯仿,剧烈震荡15秒钟,然后室温下温育3分钟。

5. 4ºC,12000g离心15分钟,形成淡红色的苯酚/氯仿有机相,中间相和上层水相,水相约占TRIzol体积的60%。

6. 转移上清于另一个Rnase-free的 50ml离心管中。根据表2加入适量异丙醇,-20ºC沉淀1小时以上。

7.  4ºC,12000g离心10分钟。

8. 去上清,据表2加入适量体积的75%的乙醇混匀。

9. 4ºC,7500g离心5分钟。

10.去上清,空气中干燥或真空抽干RNA沉淀,但不要太干。加入适量体积的DEPC-WATER,溶解沉淀。

11.取少量RNA用于测定其OD值和电泳,其余置-80ºC冰箱中保存。

表2

组织量
TRIzol Reagent
氯仿
异丙醇
75%乙醇
50~100mg
1ml
0.2ml
1ml
1ml

第二部分 mRNA 的分离

一、Oligotex mRNA Kits  (QIAGEN)法

 准备工作:

1.将Oligotex Suspension 置于37℃水浴中,旋转混匀,溶解Oligotex.,然后置于室温。

2.将OBB Buffer置于37℃水浴中,旋转混匀,重溶沉淀物,然后置于室温。

3.将OEB Buffer 置于70℃水浴中,待用。

试验步骤:

表3:加入试剂量据此表

Total RNA
RNase-free Water to:
Buffer OBB
(μl)
Oligotex
Suspension  (μl)
Prep size
<=0.25mg
250μl
250μl
15
Mini
0.25-0.5mg
500μl
500μl
30
Midi
0.5-0.75mg
500μl
500μl
45
Midi
0.75-1.00mg
500μl
500μl
55
Midi

1. Total RNA 量不要多于1mg,用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中,加RNase-free water 补足到500μl

2. 根据表3加入适当体积的OBB Buffer和Oligotex Suspension, 轻弹1.5ml离心管彻底混匀

3. 置于70℃水浴中3min

4. 取出置于室温(20℃-30℃)10min

5. 13000rpm室温离心 2min,用移液器吸出上清到一个新的1.5ml离心管中,保留上清直到polyA被结合上。

6. 用移液器取400μl OW2 Buffer混匀沉淀物,将混合物转移到 Spin Column中,RT ,13000rpm,离心1min

7. 将Spin Column 转移到一个新的1.5ml离心管中,加400μl OW2,RT,  13000rpm,离心1min

8. 将Spin Column 转移到一个新的1.5ml管中,取出25μlOER Buffer(70℃)到Column中,用移液器吹打3-4次树脂,室温 13000rpm,离心1min。

9. 取出25μl OER Buffer(70℃)到Column中,用移液器吹打3-4次树脂,室温 13000rpm,离心1min。

10.  测OD,并电泳定量。


二、磁珠法分离 mRNA

1. 在RNase-free的Eppendorf 管中加入0.1~1.0mg的总RNA和RNase-free水至终体积为500ul。

2.  65ºC加热10分钟。

3. 加入3ul生物素标记的Oligo(dT)和13ul 20×SSC于RNA中,轻轻混合,室温放置逐渐冷去至室温,一般需10 分钟左右。

4. 同时配0.5×SSC 1.2ml和0.1×SSC 1.4ml。

5. 将磁珠(SA-PMPs)轻晃散开,放入磁性分离架上,使SA-PMPs集中于管的一侧(约30sec),小心去上清,切不可离心。用0.3ml 0.5×ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分离架集中磁珠,去除上清,重复3次。

6. 将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.1ml 0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs应在30分钟内使用。

7. 将(3)中的oligo(dT)/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA―PMPs管中,轻轻摇匀,室温下放10 分钟。

8. 用磁性分离架捕获SA-PMPs,小心去上清,但不要弃去。

9.    用0.1×SSC,每次0.3ml洗3次,每次都晃至SA-PMPs悬浮,最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相,而不损坏SA-PMPs.

10.将SA-PMPs重新悬浮在0.1ml RNase-free水中,反复颠倒,使SA-PMPs散开,洗脱mRNA。

11.用磁性分离架捕获SA-PMPs,将洗脱的mRNA吸入另一个新的Eppendorf管中。

12.将SA-PMPs再悬浮于0.15ml RNase-free的水中,洗脱,与(11)步洗脱液合并。

13.将得到的mRNA溶液取几微升跑电泳,若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录,则需将得到的mRNA溶液浓缩(浓缩步骤见14-18)。

14.加0.1体积的3mol/l NaAc和1.0体积的异丙醇于洗脱液中,-20ºC沉淀过夜。

15.4ºC,13000g离心60 分钟。去上清,加入500ul 70%乙醇混匀。

16.4ºC,7500g离心10 分钟。

17.去上清,真空或空气中自然风干,但不要太干,加适量RNase-free水溶解。

18.重复步骤5-12,将步骤8保留下的样品重新上柱。

注意事项:

1.所有操作均需要严格戴手套,戴口罩进行

2.如果total RNA质量高,杂质少,就选择Oligotex的方法分离mRNA,相反则可以用磁珠法。

3.mRNA的电泳图是smear。


第三部分 cDNA 双链合成

一、 Superscipt II―RT 合成第一链 :

1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入

xμl   mRNA(大约500ng)

1μl   Xho I Primer(1.4ug/μl)

(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAG TTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)

11-x μl   RNase-free water

(大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.)

2. 混匀后,70℃反应10分钟;

3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;

4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:

4μl  5×first strand buffer

2μl   0.1M DTT

1μl  10mM dNTP(自己配制)

5. 混匀,稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;

6. 反应完成,趁热加入1 μl Superscipt II―RT,混匀;

7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.

二、 cDNA 第二链的合成 :

1. 第一链反应完成后,取2μl一链产物-20℃冰箱中保存,待电泳检测。其余的产物合并,混匀,然后顺序加入下列试剂(promega):

20μl   10×DNA Polymerase I buffer

6μl    10mM dNTP(自己配制)

xμl    dd H2O

1μl    RNase H(2U/μl)

10μl   DNA Polymerase I(10U/μl)

总体系为200μl;

2. 混匀后,16℃反应2.5小时;

3. 70℃灭活10分钟;

4. 反应完成后,得到200μl cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;

5.取2μl二链产物,同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder,确定双链的大小范围。

注:一链,二链的电泳图是smear,且二链稍比一链大一些。


三、双链 cDNA 末端补平 :

1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):

6μl   10mM dNTP

2μl   T4 DNA Polymerase(8.7U/μl)

2μl   BSA(10mg/ml)

2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;

3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;

4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;

5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;

6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;

7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;

8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.

注:第3,第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。

PCR纯化试剂盒操作流程:

1.溶液PE使用前应加入适量体积95%-100%的乙醇,混匀。

2.向200μl二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB,混匀。

3.加入spin column中,13000rpm离心1min。

4.加入0.75ml buffer PE,13000rpm离心1min。

5.13000rpm,再离心1min。

6.将spin column放入一新的离心管中,加入50μl buffer EB,静置10min。

7.13000rpm离心2min。

8.加入30μl buffer EB,静置10min。

9.13000rpm离心2min。

10.加入1/10体积3M的NaAc,2.5倍体积无水乙醇,混匀,-20℃沉淀过夜。

四、 EcoR I adaptor 加接 :

1. 往双链cDNA沉淀中加入9μl EcoR I adaptor(400ng/μl),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;

2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂:

1.2μl   10×Ligase Buffer

1μl    10mM rATP

1μl    T4 DNA Ligase(4U/μl)

3. 混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;


五、双链 cDNA 末端的磷酸化及 Xho I 酶切 :

1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA  Ligase;

2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:

1μl   10×Ligase Buffer

1μl   10mM rATP

6μl   dd H2O

1μl   T4 PNK(10U/μl)

3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;

4. 稍微离心使反应物集中至管底;

5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:

4μl   Xho 10×Buffer

2μl   BSA

5μl   ddH2O

8μl    Xho I (10U/μl)

6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;

7. 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。

六、 胶回收 cDNA(QIAEXII GEL Extraction Kit 回收试剂盒 )

1.配制小胶数板(每个样品一板):1%琼脂糖凝胶,2μl EB/300ml 胶

2.取4℃保存样品上样,40μl/孔。

3.电泳50V;1hr

4.紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.,分别放入已做标记的1.5ml离心管中。

5.称取胶重,加入三倍体积buffer QXI(例如,100mg胶中加入300μl buffer QXI)

6.50℃ 水浴数分钟,至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬,每管中加入5μl QIAEXII

7.50℃ 水浴10min,每隔2min 取出颠倒混匀数次,使QIAEX II 保持悬浮

8.4℃,13000rpm,30sec。(弃上清,离心机中甩一下,吸取上清)

9.加入500μl buffer QXI,轻弹管底使QIAEX II 重悬

10.离心并去上清(同操作8)

11.加入500μl buffer PE,重悬QIAEX II,离心30sec,去上清

12.再加入500μl buffer PE,重悬QIAEX II,离心30sec,弃上清,离心机中甩一下,吸去上清

13.超净台上吹干(至无乙醇味),加入10μl elution buffer,重悬QIAEX II,静置5min,13000rpm,30sec。吸上清,冰上放置。

14.取1μl上清上样电泳,同时做分子量标准(1kb ladder)及DNA含量标准(10ng,20ng)作对照。

15.将收回的cDNA置于-20℃内保存,据电泳结果,取适量DNA进行连接。

注意事项:

1.胶回收前电泳槽,电泳板,梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。

2.胶回收时电压要稳定。


第四部分 载体制备

一、pBlueScriptII 的提取

1.取1μl商品的pBlueScriptII,转化入大肠杆菌宿主菌中,取5μl转化产物均匀涂布在含AMP的LB平板上,37℃培养过夜。

2.第二天取一只无菌的50ml离心管,加入10ml AMP抗性的LB液体培养基,挑单克隆于离心管中,37℃,250rpm,培养过夜。

3.第三天取200µl小摇后的菌液接种于250ml 含AMP的LB液体培养基中,37℃,250rpm培养6 hr左右,使OD值达到0.6-0.8。

4.将菌液移入250ml离心管中, 4℃,3000rpm,离心15min。取出离心管,菌团朝上倒掉上清,将离心管倒置于吸水纸上使上清充分滤干。(注意离心前需配平)

5.加入10ml溶液Ⅰ(50mM Glucose , 25mM Tris-HCl,10mM EDTA, pH8.0),加入RNase至终浓度100µg/ml,晃动摇菌,使菌体充分悬浮,静置10min。

6.按NaOH(0.4N):SDS(2%)--1:1的比例新鲜配制溶液Ⅱ,加入20ml溶液Ⅱ,静置3-5min。

注: 静置时间勿超过5min,提前将溶液Ⅲ置于冰盒中。

7.加入15ml冰浴的溶液Ⅲ,冰浴15-30min。

8.4℃,5000rpm,离心15min。

9.取上清于两个50ml离心管中,弃去原离心管中的沉淀。

10.每管加入0.6倍体积的异丙醇,充分混匀,室温下放置10min。

11. 20℃,12000g,离心20min回收质粒沉淀。

12.弃上清,用70%的乙醇洗2次。

13.弃上清,倒扣于吸水纸上,尽量空干液体。

14.用3ml TE(pH8.0)溶解沉淀,移入1.5ml Eppendorf离心管中。

15.电泳检查DNA质量并定量。(必要的话,可以用胶回收的方法先纯化一下质粒再进行双酶切。)

二、pBlueScriptII的双酶切消化

1.以如下体系进行EcoRI酶切:

pBSK(+)X µl(6µg)

ddH2O174-X µl

10×Buffer E  20 µl

混匀,加入限制性内切酶:

EcoRI (10U/ µl)6 µl  

总体积为200 µl。

2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀,在离心机上甩一下。

3.37℃,水浴1hr。

4.加入200μl 1:1的酚/氯仿,混匀。4℃,13000rpm,离心15min。

5.取上清,加入等体积的氯仿,4℃,13000rpm,离心10min。

6.取上清,加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇,-20℃,沉淀30min。

7. 4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀。

8.加入200μl 70%的乙醇洗沉淀。

9.4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀。

10.自然风干沉淀,至无乙醇味,加入100μl ddH2O充分溶解沉淀。

11.加入以下试剂进行XhoI酶切:

ddH2O                   74 µl

10×Buffer D               20 µl

混匀,加入限制性内切酶XhoI:

XhoI (10U/ µl)  6 µl  

总体积为200 µl。

12.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀,在离心机上甩一下。

13.37℃,水浴1.5hr。

14.加入200μl 1:1的酚/氯仿,混匀。

15.4℃,13000rpm,离心15min。

16.取上清,加入等体积的氯仿,4℃,13000rpm,离心10min。

17.取上清,加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇,-20℃,沉淀30min。

18. 4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀。

19.加入200μl 70%的乙醇洗沉淀。

20.4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀。

21.自然风干沉淀至无乙醇味,加入40μlddH2O充分溶解沉淀,得到双酶切载体。


三、载体去磷酸化

1.在40μl双酶切载体中加入以下试剂:

6μl   10×buffer

6μlCIAP(0.01U/μl)

8μl    ddH2O

总体积60μl。

2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀,在离心机上甩一下。

3.37℃,水浴1hr。

4.70℃,15min,灭活酶。

5.电泳分离,胶回收双酶切载体,定量。

四、载体效率检测

1.按以下所示作4个连接反应:

DNA 连接酶  

1 pBlueScriptII/E/X /CIAP    - 检测酶切效率

2 pBlueScriptII/E/X /CIAP    + 检测脱磷效率,载体自连效率

3 商品Vector加标准Insert    + 对照

4 自制Vector加标准Insert    + 检测载体效率

14℃连接过夜。

2. 各取1μl连接产物作电转化(具体流程见电转化)

3.计算克隆数,计算载体相对脱磷效率及连接效率。

第五部分 cDNA 双链和载体的连接:

一、连接:

根据载体和cDNA的电泳定量结果,每个样品设置3个比例的连接,

即:insert/vector=1/3  incert/vector=1/1   insert/vector=3/1

按以下体系依次加入:

ddH2O xμl

T4 ligase 10x buffer1μl

PBK(E/X)vector(20ng/μl)    1μl

cDNA (由浓度及连接比例而定)

T4 DNA ligase(3U/μl)1μl

 Total 10μl

14℃,连接过夜 


二、检测:(PCR方法)

取适量PCR薄壁管,置于冰上,按以下体系依次加入:
               连接产物  insert  vector  阳性对照   阴性对照(H2 0)
模板:            1         1      1        1           1
10xbuffer        2.5       2.5    2.5      2.5         2.5     
Mgcl2 (25mM)       1.8       1.8    1.8      1.8         1.8
DNTP(2.5mM)        1         1      1       1            1
T3 引物(10pmol)  1         1      1       1            1       
T7 引物(10pmol)  1         1      1       1            1
Taq酶            0.4       0.4    0.4     0.4          0.4
ddH2 0            16.3      16.3    16.3    16.3        16.3
total            25ul      25ul    25ul    25ul       25ul

各试剂均加好后,离心机上甩一下,使之沉底,置于PCR仪上

反应程序:     94℃      4分钟
94℃      20秒
53.6℃   20秒      35个循环
72℃      4分钟
72℃      10分钟
4℃       24小时

待PCR反应进入4℃后,取下PCR薄壁管,取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳,同时上1Kb DNA ladder

半小时后照相,观察胶图:insert、vector、阴性三个样品除了有少量引物带(大约在200bp左右)外,均无其他带形。阳性带形清晰。好的连接产物应在500

至4、5Kb大小之内形成一条清晰的smear。

第六部分 电转化流程

一、电转化感受态细胞的制备

1. 用枪头挑取单克隆菌落,投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。(同时做培养基和枪头的空白对照)

2. 37℃,220rpm,培养14-16个小时。

3. 第二天,以1:100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中,37度,220rpm,振摇2-3小时,每半小时测一次OD,当OD值达到0.3-0.4时,停止培养。

4. 将菌液在冰上预冷30分钟,随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中,4℃,2500rpm离心10分钟。

5. 弃上清,离心杯中加入少量ddH2O,使沉淀悬浮后,再将水注满离心杯,4℃,4000rpm离心10分钟。

6. 弃上清,加少量灭菌水,重悬菌体,再将水注满离心杯,4000rpm,4℃,离心10min。

7. 弃上清,往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌,预冷),重悬菌体,再加满10%甘油,  4℃,4000rpm,离心10min。

8. 弃上清,每个离心杯中加入5ml10%的甘油,使沉淀悬浮后,将菌液以300ul/管分装于1.5ml的离心管中,-80 ℃冰箱中保存。同时取100 μl感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化,检测转化效率。

9. 次日观察转化子生长情况,并记录。

二、连接产物纯化

1.将连接产物转移至一1.5ml Eppendorf管中,加入下列试剂:

10μl  of  ddH2O

2μl  of  3M NaAC(PH5.2)

50μl of  无水乙醇

轻轻混匀,稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上;

2.4℃,top Speed 离心30分钟;

3.小心移去上清,避免接触到管底的沉淀物;

4.加入500μl70%的乙醇,轻轻颠倒几次洗涤沉淀(注:不要离心混匀);

5.4℃,top Speed离心5分钟;

6.小心移去上清,将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味;

7.加入10μlddH2O重新溶解沉淀,4℃短期保存,-20℃长期保存备用;

 


三、电转化

1. 从-80℃冰箱中取出感受态细胞,置于冰上解冻;

2. 取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中,将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。

3. 将40~100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml 的离心管中,小心混匀,冰上放置10min。

4. 打开电转仪,调至Manual,调节电压为2.1KV。

5. 将此混合物转移至已预冷的电极杯中,轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部;

6. 将电极杯推入电转化仪,按一下pulse键,听到蜂鸣声后,向电击杯中迅速加入1000μl的SOC液体培养基,重悬细胞后,转移到1.5ml的离心管中。

7.37℃,220-250rpm复苏1小时。

8. 取20ul转化产物加160ulSOC涂板,放于37℃温室,过夜培养,次日查看转化结果。其余菌液加1:1的30%的甘油后混匀-80℃保存。

注:每块加有Amp的平板上均匀涂有X-Gal 80μl ,SOC 80μl,IPTG 20 μl。

四、电击杯清洗流程

1.  用清水将电击杯稍冲一下。

2.  向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr。

3.  弃去酒精,再用蒸馏水冲洗2~3遍,然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。

4.  加入无水乙醇2ml于电击杯中,浸泡30分钟。

5.  弃去无水乙醇,于通风厨内挥干乙醇。

6.  将清洗好的电击杯放入-20 ℃冰箱内待用。

注:1.不同样品使用的电机杯应分开;

2.每周用1%酒精浸泡30分钟。

第七部分 快速鉴定、菌落PCR

一、质粒快速鉴定   

试剂:

Protoplasting buffer:

30mM Tris-HCl, pH8.00.33ml/1.0M

5mM EDTA   0.1ml/0.5M

50mM NaCl  0.1ml/5.0M

20% Sucrose5ml/40%

50µg/ml RNAseI    50ul/10mg/ml

50µg/ml lysozyme  50ul/10mg/ml

补水至10ml,-20℃分装保存。

Lysis buffer:

89mM Tris-HCl, pH8.0

89mM boric acid 2ml of 5×TBE

2.5mM EDTA

2% SDS   2ml of  10%

5% sucrose 1.25ml of 40%

0.04% bromphenol blue  4mg

补水至10ml,-20℃分装保存。

步骤:

1.将转化后的菌液铺平板,37℃过夜培养。

2.配制0 .6--0 .7%的琼脂糖TBE 胶。

3.用连续加样枪在96孔板中每孔加入10 µl Photoplasting Buffer。

4.用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至含有Photoplasting Buffer 的96孔板中,振荡混匀。

5.用连续加样枪将Lysis Buffer上样于凝胶中,每孔4 µl,用排枪将细胞与Protoplasting buffer混合液上样于凝胶中(细胞在Protoplasting buffer中不宜超过30-40 min),并点上Marker。

6.调节电压为20V(小槽)或40V(大槽),电泳15min,使细胞充分裂解,将电压调高到200V,继续电泳1hr,照相。

7.根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。


二、菌落 PCR

1.取适量PCR薄壁管,置于冰上,每管先加入17.3μl的灭菌水。

2.用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中,振荡混匀。

3.依次加入:

10xbuffer     2.5

Mgcl2 (25mM)     1.8

DNTP(2.5mM)     1 

T3 引物(10pmol)    1

T7 引物(10pmol)    1 

Taq酶    0.4

total     25μl

各试剂均加好后,离心机上甩一下,使之沉底,置于PCR仪上。

4.94℃,2min。

5.94℃ 4分钟

94℃ 40秒

53.6℃    40秒 35个循环

72℃ 4分钟

72℃ 10分钟

4℃24小时

6.待PCR反应进入4℃后,取下PCR薄壁管,取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳,同时上1Kb DNA ladder。半小时后照相,观察胶图,根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。

7.将快速鉴定和菌落PCR检测合格的文库送检。

第八部分 pBlueScript cDNA 库扩增

一、试剂及配方:

2 x LB (1升):

20g    氯化钠

20g    蛋白提取物

10g    酵母提取物

加入蒸馏水至1升,用NaOH调pH值至7.0,高压灭菌。

2 x LB-甘油(12.5%)(200ml)

175ml  2 x LB液体

25ml   甘油(100%)

加入蒸馏水至200ml,压灭菌,置于4℃备用。

二、步骤

1.将cDNA文库转入大肠杆菌,如DH5a(DH10B)后,取少量菌液涂布氨苄平板,以推算克隆总量。

2.取一大小合适的三角瓶,根据克隆总量配制2 x LB液体,每500ml 2 x LB液体可扩增5x105个克隆,可以适当增加2 x LB液体的量,但不能少于此比例

3.按每100ml加0.3g的比例在2 x LB液体中加入SeaPrep agarose。

4.70℃加热搅拌至琼脂糖溶解,高压灭菌后再70℃搅拌30分钟。

5.37℃放置1小时。

6.加入适量安苄青霉素,使之终浓度为50ug/ml。

7.加入全部菌液,并轻柔旋转使之混匀,避免振荡。

8.将三角瓶置于冰水中1小时,水面必须没过三角瓶内液面。

9.轻轻取出三角瓶,30℃培养40-45小时。

10.将三角瓶内容物全部转入离心管中,离心10,000g ,20分钟,必须室温。

11.弃上清,每100ml培养基离心得到的沉淀用10ml 2x LB-甘油(12.5%)重悬。

12.将重悬液留下10ul检测滴度,其余分装于1.5ml离心管,-80℃冰箱内保存。

13.取1ul扩增后菌液倍比稀释。

14.各取10ul 稀释为10-5和10-6的菌液涂布于含安苄青霉素的LB固体平板上,37℃过夜培养,次日计算其克隆数以及扩增后总克隆数。

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