引物设计常见问题与解答(二)

1. 长链引物为什么出错的几率非常高？

答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%,产生碱基插入，缺失，置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。

但是犹如PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。

2. 如果测序发现突变，该如何处理？

答：对您遇到的困惑，我们表示同情。遇到这种情况，首先和我们取得联系，我们的生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，我们在电脑中保留所有原始数据。如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆的。

根据我们经验，40个碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个克隆突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。

您也可以要求我们将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。

3. 如果测序发现引物突变，是否有补偿？

答：没有。我们可以免费重合一次，没有其他任何补偿或赔偿，不承担其他连带责任。原因我们在前面已提到，化学合成效率不可能达到100%.您选择了化学合成引物，合成过程中一些副产品所带来的后果就可能不可避免的遇到。

4. 引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？

答：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。

国内有一个不好的现象，PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少OD数，引物遇到的问题可能就会少一些。

5. 为什么OPC或PAGE纯化的引物，再用HPLC鉴定纯度不高？

答： 有些用户引物需要纯度特别高的引物，在使用前会将HPLC鉴定引物的纯度，常常发现引物的纯度一般在70%左右。问题来了，还有那30%是什么？ 引物纯化PAGE, 需要电泳，用缓冲液将引物浸泡出来，然后用C18浓缩，乙醇沉淀。

沉淀得到的核酸物质基本引物了，除此以外，还有其他一些非核酸类物质，他们一般不会干扰引物的使用。OPC纯化也类似的情况。即使是HPLC纯化的引物，如果对成品进行分析，一般也难达到很高的纯度，引物您得到的纯品都是由制备柱过来，洗脱峰经过浓缩抽干，部分非核酸物质被富集。

6. 为什么修饰引物的产量要比一般引物低，价格要高？

答：主要因为是修饰单体稳定性较差，偶连时间长，效率低，最后得到的产量自然低于一般的引物。修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化，纯化过程损失大。修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍，所以产品的价格自然高。

23. TaqMan 探针设计的基本原则是什么？

答：下列原则供您参考。

◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。

◆长度一般为18-40mer .

◆G-C含量控制在40-80%左右。

◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。

◆在引物的5‘端避免使用G.

◆选用比较多的碱基C.

◆退火温度Tm控制在 68-70C左右。

有用的荧光染料参数

Name	Name	吸收波长	发射波长	colors
6-FAM	6-carboxy-fluorescein	494nm	518nm	Green
TET	5-tetrachloro-fluorescein	521nm	538nm	Orange
HEX	5-hexachloro-fluorescein	535nm	553nm	Pink
TAMRA	tetramethyl-6-carboxyrhodamine	560nm	582nm	Rose
ROX	6-carboxy-x-rhodamine	587nm	607nm	Red
Cy3	Indodicarbocyanine	552nm	570nm	Red
Cy5	Indodicarbocyanine	643nm	667nm	Violet

24. Primer设计的基本原则是什么？

答：引物设计的下列原则供您参考。

◆引物长度一般在18-35mer.

◆G-C含量控制在40-60%左右。

◆避免近3’端有酶切位点或发夹结构。

◆如果可能避免在3‘端最后5个碱基有2个以上的G或C.

◆如果可能避免在3’端最后1个碱基为A.

◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。

◆退火温度Tm控制在 58-60C左右。

◆如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。

25. 用软件设计的引物为什么不管用？

答：引物是否好用，能否扩增出您需要的引物，与是否用软件设计没有太多的关系。引物设计有一定的指导意见，软件就是根据这些要求设计而成。不要迷信软件给您设计的引物，软件中一些参数您可能不明白，弄错了反而麻烦。其实，PCR扩增的成败最关键的是反应模板的制备和反应条件的控制。软件设计最大的毛病是，有时判断为该基因没有一段区域满足标准引物的要求。有时，我们需要扩增一段基因片段，引物的设计是没有太多的选择的。

26. 为什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？

答：我们多次接到类似的投诉：引物应该全是DNA,但是OD260/OD280的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染？遇到这样的投诉有时我们感到很是为难。投诉者有时心情很不好，还不听解释。撇开其他不谈，引物化学合成，哪里有机会污染到蛋白质？

需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。下表是一个20mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。

A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions
Base Composition	A260/280
5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3	2.50
5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3	1.85
5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3	1.15
5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3	1.14
5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3	1.66

27. 同样的OD用PAGE检测，EB染色为什么深浅不一？

答：通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量（如质粒DNA），因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA,由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会有差异，比如Oligo（dT）等不形成二级结构，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。同样道理，用EB染色来照片不适合所有引物。

28. 引物不纯会有什么后果？

答：引物不纯可能会导致：1）非特异性扩增；2）无法用预先设计在引物5‘端酶切位点的酶切开，特别是没有保护碱基的引物；3） 用于测序出现双峰或乱峰。解决办法重新合成或重新纯化。

29. 为什么我们的引物重合了几遍都扩增不出来？

答：有些PCR扩增没有成功，怀疑是引物不好。要求我们重合，没有问题。可是有时遇到重合数次的引物PCR扩增还是不成功。这种情况的出现一般都是用户自己的原因。对于引物合成，我们只能做到合成的引物没有问题，至于您是否能够扩增出来您需要的产物，那得靠您自己对实验本身的理解和把握。我们不能杜绝我们不犯错误，但是引物合成犯同样错误的几率很小，想犯同样的错误都难。

PCR扩增不成功的因素很多，需要您耐心地分析，最好在实验时设置对照来判定原因。

如果您怀疑引物的问题，请您首先测定您溶解的引物的OD值，看实验时加入的引物量是否正确。如果量是正常的，请您告诉我司您的引物编号，我们会复查留存样品。如不明原因，我们免费为您重新合成一次。如果仍然不能扩增，请您查找其它原因。

30. 已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？

答：如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻溶。建议使用10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物，因为因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）， 引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。

31. 引物质量好坏的判断标准是什么？

答：合成的引物和您的定单序列一致，而不是能否扩增出您所需要的产物。

32. 引物是我们设计的，现在您扩不出来，我们要负责吗？

答：不负责任。我们免费为一些实验经验不足的人员，免费设计引物。引物设计好，我们都会发给您确认。设计引物时我们遵循一般的指导原则，但是设计的引物是否能够满足您的实验要求，扩增出您需要的基因片段，我们就不能保证了。我们遇到一些用户，他们讲：引物是你们设计的，也是你们合成的，我做不出，你们就要付责任。听到这样的抱怨，觉得心寒。

33. PCR扩增不出就引物有问题吗？

答：基本不是。当今发展出各色各样的PCR扩增技术，各色各样的高温聚合酶，就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出，扩增效率低的问题。如槽式PCR就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。 有些重复片段的扩增， GC含量高的片段，非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。

引物扩增不出，主要是下列两种情况比较常见（1） RT-PCR.请注意，很多基因通过常规RT –PCR方法是很难不增出来的。 RT- PCR成功的关键在于RT的反应的RNA质量和目标基因在特定组织和细胞中含量。（2）从基因组中扩增。一般情况下，基因在基因组中都是单拷贝，基因组作为模板需要严格控制用量。基因组DNA过高，会影响反应体系中的Mg和pH.

34. PCR扩增有很强的非特异条带，说明引物有污染吗？

答：不能。瞧，扩增目标很弱或没有，道是非特异性条带很亮，说明引物不纯或有污染。一些用户如是说。我们曾分析过一些非特异条带，测序发现在这些非特异性片段的两头至少可以发现一条引物序列。我们只能说非特异性扩增一般是模板污染（如RNA中污染基因组）或扩增条件不合适所致。

35. 引物合成的价格合理吗，还有下浮的空间吗？

答：不合理。对引物合成的成本，我们做了准确的统计和评估，认为现阶段引物的价格处于一种非理性化状态，价格已基本探底。引物合成的成本主要由四部分组成：（1）合成原料 （2）设备折旧 （3）人员费用 （4）场地和水电等消耗。其中合成原料占生产成本占30%，设备折旧占30%，人员费用占20%，场地和水电消耗等20%.我们的合成成本控制是相当到位，原料管理也非常严格，原料进货成本不可能高于同行。现行的引物合成价格，已让我们感到十分吃力。我们需要对我们的用户负责，我们需要体现做人的准则，我们需要交税，我们需要收回设备的采购费用，我们需要给我们的用户提供配套服务，这些需要才使我们还在做引物合成。