方案二

第二种方法，也称为"nested peptide secquendng", 是在一个 Edman 降解循环中多次加入多肽/蛋白质底物心在此法中加入过量易挥发的 Edman 试剂以使反应完全，每一循环中的过显试剂可通过蒸发被除去。经 MALDI-MS 分析得到肽序列阶梯，实现阶梯测序。这两种方法都需要底物蛋白质为自由 N 末端，并且不能分辨同质异核氨基载残基亮氨酸和异亮氨酸 谷氨酰胺（残基质量 128. 13) 和赖氨酸（残基质量 128. 17), 在CID 谱中很难分辨，但在这两种方法中可轻易分辨 。CID为赖氨酸侧链的氨基会被反应试剂修饰。理论上讲，这两种方法都能分析肽混合物，只要肽段之间质量差异明显，不会与降解产物质量重叠。除（逐步化学降解法，氨肽酶和羧肽酶也可以截短肽段产生肽阶梯序列。此方法的好处是可以将很少量的起始反应物直接放在MALDI 样品靶的表面反应， 只要加入基质就可以终止反应。通过控制反应时间可以改出较长的序列，此方法不能分辩 Gln 和Lys 及 Ile 和 Leu 。如果 CID 能产生高质量的谱，例如谱图含有完整的，和 b 系列离子，那么，通过对碎片离子的从头解析可以确定肽段的序列。但是，通营对 y 和 b 离子的判断具有很低的置信度，使得读出的终序列很困难。使 CID 谱图解析变得复杂的主要因素包括：①碎片离子只失，如产生不完整的离子系列；②将观察到的信号归展为某一特定离子系列较困难。通过在酶切过程中对 C未端离子的特异性同位素标记，可以使 y 系列离子的鉴别变得较为容易。

这一方法利用了胰蛋白酶的水解特性，即在 C 末端新生成的羧基中从水分子中结合一个氧。因此，如果在胰蛋自酶水解缓冲液中含有 H₂¹⁸O. 那么所含的肽段（除了(末端肽段）都会有一个同位素标记的 C 末端羧基团 。通过在含 50% H₂¹⁸O /H₂¹⁶O的缓冲液中进行胰蛋白酶酶切反应，所有的新生肽段（除了 C 末端肽段）都将表现为一对峰，两峰质量数相差 2个质量单位，同时他们的离子强所也只有在 H₂¹⁶0 溶液中正常水解产生肽段离子强度的一半 。胰蛋白酶切点在赖氨酸和精氨酸之后的肽键，通过激活胰蛋白酶 195 位丝氨般的 OH 基团，与赖氨酸或精氨算的羧基形成共价结合的速同时释放新形成的 N 末端。活性水分子攻击过渡态使酯键断裂，释放新生肽段，肽段的羧基上含有一个从溶剂水中获取的氧，溶剂水为H₂¹⁸O /H₂¹⁶O的机率相当。这样，当这两种离子都被质谱仪选择为母离子时，只有具完整 C 末端的离子系列(y 系列离千及其中性丢失离子）会以相差 2u 的双峰存在。这样就区别出 (y 系列离子并可计算出序列差异令对肽段进行从头测量，虽然这种方法简化（对特定离子系列的确认，但也减小（每一个 y 离子的信号强理，围此使高灵敏度的测序更为困难。使用高分辨的质谱仪如四极杆-飞行时间串联质谱仪可以实现在单次实验中对肽段谱图的完全解析, 同时这种方法已成功应用于离子阱质谱仪。