二抗

互联网2013-08-19

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二抗在免疫学实验中起着举足轻重的作用，二抗的选择也决定了整个实验的成败。实验中在选择二抗时必须注意以下几点：

（1）一抗种属来源

主要根据一抗种属来源来决定确定二抗的类型，如一抗是小鼠来源，那二抗就买抗小鼠的即可（如羊抗小鼠、兔抗小鼠等均可）。

（2）一抗类型

二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。这通常是针对单克隆抗体而言。多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体.

单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。

如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。

在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下，可以选用抗相应物种IgG。

（3）标记物的选择

一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），荧光基团（FITC, RRX, TR, PE）和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于western blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗，而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗，免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用biotin/avidin检测系统。

下面简单介绍几种二抗探针的优缺点及其适用的实验：

a. 酶：
主要有两种不同的酶耦联物，HRP和AP。比较而言，前者更经济、快速、稳定，而后者较前者更为灵敏，通常情况下，HRP广泛应用于免疫组化，western blot和ELISA中，而碱性磷酸酶（AP）更适合于固相的免疫检测实验，如ELISA和western blot.

b. 荧光基团：
FITC ：FITC是广泛使用的荧光基团，但其最大的缺点是淬灭快，使用抗淬灭剂可以减轻。
AMCA：常用在多标记实验中，如免疫荧光、流式细胞术。其缺点是，淬灭快，且由于肉眼不能很好的检测其所激发的蓝色荧光，因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量存在的抗原。
花青染料（Cy2,Cy3,Cy5）：Cy2比FITC更稳定，且在表面荧光显微镜下，Cy2的荧光FITC更强。Cy3和Cy5比大多数荧光基团更亮，更稳定，背景更弱。二者常在共聚焦显微实验中作多标记。但Cy5的缺点是不能用表面荧光显微镜观察，因此通常用具有远红外检测器的共聚焦显微镜观察。
TRITC,RRX,TR:TRITC经常和FITC一起用于双标记实验中，也可以使用RRX或TR，但TR会产生较高的背景。在使用装有氪氢灯的激光共聚焦扫描显微镜作三标记实验时，RRX尤其有用，可以和Cy2（或FITC）及Cy5一起使用，因为RRX的发射波长在Cy2和Cy5中间，且和这两者的重叠很少。
PE：常和FITC一起用于流式细胞术双标记实验。

注：由于观察荧光需要一定波长的激发光，必须根据实验室已有的仪器可发光的波段进行选择。

荧光素根据其发射波长可分为：

<499nm，蓝色荧光（Blue）

500-549nm，绿色荧光（Green）

550-584nm，黄色荧光（Yellow）

585-615nm，橙色荧光（Orange）

616-700nm，红色荧光（Red）

>=700nm，远红外荧光（Far-Red）

几种新型荧光基团

荧光基团	颜色	激发光波长（nm）	发射光波长（nm）
DyLight 488		493	518
DyLight 549		550	568
DyLight 649		646	674
DyLight 680	Near Red	682	715
DyLight 800	Infrared	770	794

n 荧光亮度更强

n 发光更持久适合于荧光拍照

n 灵敏度更高

n 高信噪比、低背景

n 稳定性更好适用于pH4～9的各种缓冲系统中

c. 生物素：
生物素（biotin）可以和抗生素蛋白/链酶亲和素（avidin/streptavidin）发生不可逆反应而紧密结合在一起。首先加入生物素标记的二抗，在加入耦联有酶或荧光集团的avidin或streptavidin，后者能够结合于二抗表面的多个位点上，从而极大的放大检测信号。

(责任编辑：大汉昆仑王)

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