引物设计常见问题与解答(一)

1. 引物是如何合成的？

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种， 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。申能博彩公司采用的合成仪主要机型为ABI3900高通量合成仪，合成长链主要采用Beckman 1000M和PE8909 DNA合成仪，引物修饰和高OD数合成采用ABI394等。

亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3‘端向5’端合成的，相邻的核苷酸通过3‘→5’磷酸二酯键连接。

第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT,获得游离的5'-羟基；

第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3‘端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。

第三步，带帽（capping）反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应（少于2%），用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩，脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。

2. 引物纯化方式有哪些，如何选择？

◆ C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。

◆ OPC纯化： OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于95%.适用于40mer以下引物的纯化。

◆ PAGE纯：PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%,对长链Oligo DNA （大于50mer）的纯化特别有效。

◆ HPLC纯化：HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%.主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。

3. 引物的OD数如何定量？

答：引物合成引物OD数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm,石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测OD值。需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。

4. 投诉定量不准是怎么回事儿？

答：我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告，出现这种情况的可能性有（1）生产人员定量错误。这种可能性有，但是不大，因为我们的生产人员都是经过严格的培训，程序化规范操作和换算。公司内部的考核机制也使得分装人员没有必要故意少给用户OD数，因为无论OD数是否达到定单要求，我们都统计为工作量，没有达到OD数的，分装人员将清单及时报到序列录入部门安排重合就可以了。合成产量的高低是序列录入部门人员的考核指标之一。一般情况下，引物都有留样。接到用户投诉后，我们都会找出留样重新定量，一般都没有问题。（2）分装没有问题，但引物抽干或收样过程中，引物干粉可能意外丢失。这种情况很少见。（3）系统误差，我们认为10%左右为允许误差。使用过程中，引物工作浓度范围很宽，定量上的少许偏差不影响实验。（4）用户没有能够正确理解引物OD数的含义，没有能够正确使用分光光度计，特别是使用微量测定；用户没有将OD读数，正确地转换成母液中OD数。这种情况比较常见。（5）用户收到引物干粉时，打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。

例如，验证标2OD引物量是否准确，简单的做法是： 加入1ml水，彻底溶解混匀后，取100ul, 加入900ul水，用光径为1cm的石英比色杯，波长260nm, 此时光吸收的读数为0.2.

5. 需要什么级别的引物？

答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。

应用	引物长度要求	纯度级别要求
一般PCR扩增	< 45base	OPC
>45 base	PAGE
诊断PCR扩增	< 40base	OPC, PAGE
测序	20base左右	OPC
亚克隆，点突变等	根据实验要求定	OPC, PAGE,HPLC
基因构建（全基因合成）	根据实验要求定	PAGE
反义核酸	根据实验要求定	PAGE
修饰引物	根据实验要求定	PAGE, HPLC

6. 最长可以合成多长的引物？

答：引物越长，出现问题的概率就越大。我们合成过120base的引物，但是产率很低。除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%,后续处理还有丢失很多，最后的产量是很低。

7. 需要合成多少OD数？

答：根据实验目的确定。一般PCR扩增，2 OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。但是有些研究人员，就做几次PCR,但是却要5-10 OD.做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。片段越长， 最后全长得率就越低，出错的几率就越大。超出需要之外的OD数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员，特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。

8. 如何检测引物的纯度？

答：实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性（95℃，2mins）。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后（约2-3小时），剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用EB 染色或银染方式染色。

9. 如何计算引物的浓度？

答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成10-50pmol/ul. 溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。如果不一致，请和我们联系。我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。

一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成50pmol/ul,加水的体积（微升）按下列方式计算：V （微升）= OD数（乘）33 *（乘）（乘）20000 / （除） 引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。

注意：1 OD260= 33 ug/ml。

10. 如何计算引物的Tm值？

答：引物设计软件都可以给出Tm,引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。

长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃（G + C）+ 2℃（A + T）

对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na⁺] + 0.41 （%GC） – 600/size

公式中，Size = 引物长度。

Tm的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature.  The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.

11. 引物（含修饰）的分子量是如何确定的？

答：非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量。或按下列公式计算MW= （NA * WA） + （NC * WC） + （NG * WG） + （NT * WT） +（Nmod * Wmod） +（Nx * Wx）+（ Nundefined Wi） +1undefined Ns– 62.

NA，NG，NC，NT，Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA，WC，WG，W，Wi分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。

对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分子量为（313.21+329.21）/2 = 321.21.Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。

常规碱基分子量

Base	Molecular Weight
A	313.21
C	289.18
G	329.21
T	304.19
I	314.2
U	290.17

常规修饰基团分子量

5'-Biotin	405.45	3'-TAMARA	623.60
5'-（6 FAM）	537.46	3'-Dabsyl	498.49
5'-HEX	744.13	3'-（6 FAM）	569.46
5'-TET	675.24	3'-Amino Modifier C3	153.07
5'-Cy5	533.63	3'-Amino Modifier C7	209.18
5'-Cy3	507.59	3'-Thiol Modifier C3	154.12

 

12. 如何溶解引物？

答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5），引物在这种条件下不稳定。

13. 如何保存引物？

答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。

14. 合成的引物5‘端是否有磷酸化？

答：合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5‘端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5’或3‘端进行磷酸化，需要另外收费。

15. 引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？

连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。

16. 测序发现引物有突变是怎么回事？

答：测序发现引物区域有突变，特别是40个碱基以下的引物， 发生的概率不大，但是肯定也会发生。用户一般可以放心，引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列COPY到合成仪的，碱基输错的机会不多。我们有一套控制办法，预防碱基输入错误。发生这种突变的原因有很多解释，人们还没有办法彻底解决这个问题。引物合成的固相合成原理都一样，采用的机器也基本相同，合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的，所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似，没有人可以超脱。

引物合成是一种多步骤的化学反应，合成效率最高也就是99%,副产品不可以避免。引物序列中插入突变往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分单体发生丢失DMT,导致单体又接了上去，故发生插入同一碱基的突变。至于缺失突变，一般认为是一般认为是带帽（capping）反应不彻底造成的，Caping反应主要是封闭极少数5'-羟基没有参加反应单体。被封闭的引物，在下一轮偶连时将不能继续参与合成。对于碱基置换的突变，产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，引物的这些区域不能很好地与互补链配对，当扩增的产品被亚克隆转化到大肠杆菌中，可能被细菌中修复系统补上了非配对的碱基。置换突变通常发生在G 转换成其它碱基。碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体 （脱嘌呤），2,6 diaminopurine , DNA复制和扩增过程中DNA聚合酶将2,6 diaminopurine看作碱基A,测序就会发现碱基G-A置换。脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。脱嘌呤的引物在引物后处理脱保护阶段如果被降解，测序就会发现碱基G或A的缺失。

引物合成过程中，造成碱基插入，缺失，置换突变的因素客观存在，有不少降低发生的频率建议和措施，但是这些措施还停留在实验室阶段，还没有能够应用到规模化生产中。