PCR 引物设计及评价实验

聚合梅链式反应（polymerase chain reaction）即 PCR 技术，是一种在体外快速扩增特定基因或 DNA 序列的方法，故又称基因的体外扩增法。PCR 技术已成为分子生物学研究中使用最多，最广泛的手段之一，而引物设计是 PCR 技术中至关重要的一环，使用不合适的 PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱等等。现在 PCR 引物设计大都通过计算机软件进行，可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。

目的基因序列，电脑

一、引物搜索

1、打开 Primer premier 5.0 软件，调入人瘦素（leptin）基因序列：点击「file」「open」「DNA sequence」；或者直接点击「file」「new」「DNA sequence」，弹出一对话框如下图，然后将序列人瘦素（leptin）基因复制在空白框。





2、序列文件显示如图，点击「Primer」；



3、进一步点击「search」按钮，出现「search criteria」窗口，有多种参数可以调整。搜索目的（Seach For）有三种选项，PCR 引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交探针（Hybridization Probes）。搜索类型 (Search Type) 可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或 Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。我们将 Product Size 设置 300~350，其他参数使用默认值。



然后点击「OK」 ，随之出现的 Search Progress 窗口中显示 Search Completed 时，再点击「OK」。



4、这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物（Anti-sense），成对显示（Pairs）。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分为 100，即各指标基本都能达标。



5、按照搜寻结果显示，在主窗口中检查该引物对的二级结构情况，逐条分析，依次筛选。下面进行序列筛选：点击其中一对引物，如第 21 # 引物，在「Peimer Premier」主窗口，如图所示：该图分三部分，最上面是图示 PCR 模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由「None」变成「Found」，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有「Found」，只有「None」。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。



二、引物分析

1、打开 oligo 的页面如下：

2、单击 file 菜单再点 open 或点击「打开」快捷图标或者用快捷键「Ctrl＋O」可弹出一对话框，然后选择序列人瘦素（leptin）基因。出现以下窗口。

3、点击「window」再点击「Tile」，出现以下窗口，图中显示的三个指标分别为 Tm、ΔG 和 Frq，因为分析要涉及多个指标，起动窗口的 cascade 排列方式不太方便，可从 windows 菜单改为 tile 方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标。

∆G 值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的∆G 值在 5' 端和中间值比较高，而在 3' 端相对低。

Tm 值曲线以选取 72 ℃ 附近为佳，5' 到 3' 的下降形状也有利于引物引发聚合反应。

Frq 曲线为「Oligo 6」新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用 3' 端 Frq 值相对较低的片段。

4、在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击 Tm 图块上左下角的 Upper 按钮，选好上游引物，此时该按钮变成红色，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成 Lower。

5、当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价。可以用「Analyse」菜单分析你的引物：比如有无引物二聚体、发卡结构等等。首先检查引物二聚体尤其是 3'端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性 PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过 4.5 为好。当然，在设计克隆目的的 PCR 引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种 PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为 GC 含量，以 45~55％ 为宜。有一些模板本身的 GC 含量偏低或偏高，导致引物的 GC 含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的 GC 含量以及 Tm 值保持接近，以有利于退火温度的选择。

当我们结束以上三项检测，按 Alt+P 键弹出 PCR 窗口，其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm 值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。

在填 antisense 时要注意 3' 到 5' 翻转成 5' 到3'。

一、引物设计原则如下

1、引物应在序列的保守区域设计并具有特异性。引物序列应位于基因组 DNA 的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性；

2、引物的长度一般为 15~30 bp。常用的是 18~27 bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于 74 ℃，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应；

3、引物不应形成二级结构。引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过 4.5 kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常进行；

4、引物序列的 GC 含量一般为 40~60%。过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量不能相差太大；

5、引物所对应模板位置序列的 Tm 值在 72 ℃ 左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式 Tm = 4（G + C）+ 2（A + T）；

6、引物 5' 端序列对 PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。可根据下一步实验中要插入 PCR 产物的载体的相应序列而确定。

7、引物 3' 端不可修饰。引物 3' 端的末位碱基对 Taq 酶的 DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为 A 的错配效率明显高于其他 3 个碱基，因此应当避免在引物的 3' 端使用碱基 A。

8、引物序列自身或者引物之间不能在出现 3 个以上的连续碱基，如 GGG 或 CCC，也会使错误引发机率增加；

9、G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用 3' 端 G 值较低（绝对值不超过 9），而 5' 端和中间 G 值相对较高的引物。引物的 3' 端的 G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应；值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如 GC 含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的 PCR 因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低，在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。