我是要扩增一个片段，加上双酶切位点，片段就那么大，我就需要那么大加酶切位点？这引物怎么设计？是不是只要5‘端序列，以及3’端的反

5'端加上酶切位点不影响你扩增目的片段，网上用软件设计可以直观作出对引物的评价。你也可以自己设计，符合一些引物设计原则就好

对，你说的很对，就是5‘端序列，以及3’端的反向互补序列加上酶切位点和保护碱基就好。但是软件包含了可调节的参数以设计最佳的引物长度。这些参数涉及了引物的Tm值、互补性、二级结构以及扩增子大小等重要因素。

设计的方法跟你说的差不多,之所以使用软件,软件计算对物的Tm值,GC含量,以及两个引物之间是否会形成二聚体,这样就可以通过分析结果来调整两条引物的长度使上下游的引物扩增效率更高。

设计引物，我们都是用软件设计啊!难道你要……手动设计吗？一般设计引物有下面几个原则，引物最好在模板cDNA的保守区内设计，引物长度一般在15-30碱基之间，引物GC含量在40%-60%之间，Tm值最好接近72℃，引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。