本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列,如
AccI
,
AflIII
,
AscI
,
AvaI
,
BamHI
,
BglII
,
BssHII
,
BstEII
,
BstXI
,
ClaI
,
EcoRI
,
HaeIII
,
HindIII
,
KpnI
,
MluI
,
NcoI
,
NdeI
,
NheI
,
NotI
,
NsiI
,
PacI
,
PmeI
,
PstI
,
PvuI
,
SacI
,
SacII
,
SalI
,
ScaI
,
SmaI
,
SpeI
,
SphI
,
StuI
,
XbaI
,
XhoI
,
XmaI
,
为什么要添加保护碱基?
在分子克隆实验中,有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点,用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开,因此在设计
PCR
引物时,人为的在酶切位点序列的
5‘
端外侧添加额外的碱基序列,即保护碱基,用来提高将来酶切时的活性。
其次,在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时,相临的两个酶切位点往往不能同时使用,因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基?
添加保护碱基时,最关心的应该是保护碱基的数
目,而不是种类。什么样的酶切位点,添加几个保护碱基,是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基,如果严格点,是根据两条引物的
Tm
值和各引物的碱基分布及
GC
含量。如果某条引物
Tm
值偏小,
GC%
较低,添加时多加
G
或
C
,反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求,
NEB
采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时),或者当切割位点靠近
DNA
末端时也很有用。在本表中没有列出的酶,则通常需在识别位点两端至少加上
6
个保护碱基,以确保酶切反应的进行。
实验方法:用
γ-[32
P]ATP
在
T4
多聚核苷酸激酶的作用下标记<chmetcnv>0.1A</chmetcnv>260
单位的寡核苷酸。取
1µg
已标记了的寡核苷酸与
20
单位的内切酶,在<chmetcnv>20°C</chmetcnv>条件下分别反应
2
小时和
20
小时。反应缓冲液含<chmetcnv>70mM</chmetcnv>Tris-HCl (pH 7.6),<chmetcnv>10 mM</chmetcnv>MgCl2
, 5 mMDTT
及适量的
NaCl
或
KCl
(视酶的具体要求而定)。
20%
的
PAGE
(<chmetcnv>7M</chmetcnv>尿素)凝胶电泳分析,经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构,切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
| 酶 | 寡核苷酸序列 | 切割率
% |
| 2 hr | 20 hr |
| Acc I
| G
GTCGAC
C CG
GTCGAC
CG CCG
GTCGAC
CGG | 0 0 0 | 0 0 0 |
| Afl III | C
ACATGT
G CC
ACATGT
GG CCC
ACATGT
GGG | 0 >90 >90 | 0 >90 >90 |
| Asc I | GGCGCGCC A
GGCGCGCC
T TT
GGCGCGCC
AA | >90 >90 >90 | >90 >90 >90 |
| Ava I | C
CCCGGG
G CC
CCCGGG
GG TCC
CCCGGG
GGA | 50 >90 >90 | >90 >90 >90 |
| BamH I
| C
GGATCC
G CG
GGATCC
CG CGC
GGATCC
GCG | 10 >90 >90 | 25 >90 >90 |
| Bgl II | C
AGATCT
G GA
AGATCT
TC GGA
AGATCT
TCC | 0 75 25 | 0 >90 >90 |
| BssH II | G
GCGCGC
C AG
GCGCGC
CT TTG
GCGCGC
CAA | 0 0 50 | 0 0 >90 |
| BstE II | G
GGT(A/T)ACC
C | 0 | 10 |
| BstX I | AACTGCAGAA
CCAATGCATTGG AAAACTGCAG
CCAATGCATTGG
AA CTGCAGAA
CCAATGCATTGG
ATGCAT | 0 25 25 | 0 50 >90 |
| Cla I
| C
ATCGAT
G G
ATCGAT
C CC
ATCGAT
GG CCC
ATCGAT
GGG | 0 0 >90 50 | 0 0 >90 50 |
| EcoR I
| G
GAATTC
C CG
GAATTC
CG CCG
GAATTC
CGG | >90 >90 >90 | >90 >90 >90 |
| Hae III
| GG
GGCC
CC AGC
GGCC
GCT TTGC
GGCC
GCAA | >90 >90 >90 | >90 >90 >90 |
| Hind III | C
AAGCTT
G CC
AAGCTT
GG CCC
AAGCTT
GGG | 0 0 10 | 0 0 75 |
| Kpn I
| G
GGTACC
C GG
GGTACC
CC CGG
GGTACC
CCG | 0 >90 >90 | 0 >90 >90 |
| Mlu I
| G
ACGCGT
C CG
ACGCGT
CG | 0 25 | 0 50 |
| Nco I
| C
CCATGG
G CATG
CCATGG
CATG | 0 50 | 0 75 |
| Nde I | C
CATATG
G CC
CATATG
GG CGC
CATATG
GCG GGGTTT
CATATG
AAACCC GGAATTC
CATATG
GAATTCC GGGAATTC
CATATG
GAATTCCC | 0 0 0 0 75 75 | 0 0 0 0 >90 >90 |
| Nhe I | G
GCTAGC
C CG
GCTAGC
CG CTA
GCTAGC
TAG | 0 10 10 | 0 25 50 |
Not I | TT
GCGGCCGC
AA ATTT
GCGGCCGC
TTTA AAATAT
GCGGCCGC
TATAAA ATAAGAAT
GCGGCCGC
TAAACTAT AAGGAAAAAA
GCGGCCGC
AAAAGGAAAA | 0 10 10 25 25 | 0 10 10 90 >90 |
Nsi I | TGC
ATGCAT
GCA CCA
ATGCAT
TGGTTCTGCAGTT | 10 >90 | >90 >90 |
Pac I | TTAATTAA G
TTAATTAA
C CC
TTAATTAA
GG | 0 0 0 | 0 25 >90 |
Pme I | GTTTAAAC G
GTTTAAAC
C GG
GTTTAAAC
CC AGCTTT
GTTTAAAC
GGCGCGCCGG | 0 0 0 75 | 0 25 50 >90 |
Pst I | G
CTGCAG
C TGCA
CTGCAG
TGCA AA
CTGCAG
AACCAATGCATTGG AAAA
CTGCAG
CCAATGCATTGGAA CTGCAG
AACCAATGCATTGGATGCAT | 0 10 >90 >90 0 | 0 10 >90 >90 0 |
Pvu I | C
CGATCG
G AT
CGATCG
AT TCG
CGATCG
CGA | 0 10 0 | 0 25 10 |
Sac I | C
GAGCTC
G | 10 | 10 |
Sac II | G
CCGCGG
C TCC
CCGCGG
GGA | 0 50 | 0 >90 |
Sal I | GTCGAC
GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GC
GTCGAC
GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGC
GTCGAC
GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA | 0 10 10 | 0 50 75 |
Sca I | G
AGTACT
C AAA
AGTACT
TTT | 10 75 | 25 75 |
Sma I | CCCGGG C
CCCGGG
G CC
CCCGGG
GG TCC
CCCGGG
GGA | 0 0 10 >90 | 10 10 50 >90 |
Spe I | G
ACTAGT
C GG
ACTAGT
CC CGG
ACTAGT
CCG CTAG
ACTAGT
CTAG | 10 10 0 0 | >90 >90 50 50 |
Sph I | G
GCATGC
C CAT
GCATGC
ATG ACAT
GCATGC
ATGT | 0 0 10 | 0 25 50 |
Stu I | A
AGGCCT
T GA
AGGCCT
TC AAA
AGGCCT
TTT | >90 >90 >90 | >90 >90 >90 |
Xba I | C
TCTAGA
G GC
TCTAGA
GC TGC
TCTAGA
GCA CTAG
TCTAGA
CTAG | 0 >90 75 75 | 0 >90 >90 >90 |
Xho I | C
CTCGAG
G CC
CTCGAG
GG CCG
CTCGAG
CGG | 0 10 10 | 0 25 75 |
Xma I | C
CCCGGG
G CC
CCCGGG
GG CCC
CCCGGG
GGG TCCC
CCCGGG
GGGA | 0 25 50 >90 | 0 75 >90 >90 |
| | | | |
注释:
1
.如果要加在序列的
5‘
端,就在酶切位点识别碱基序列(红色)的<chmetcnv>5’</chmetcnv>端加上相应的碱基(黑色),相同如果要在
3‘
端加保护碱基,就在酶切位点识别碱基序列(红色)的<chmetcnv>3’</chmetcnv>端加上相应的碱基(黑色)。
2
.切割率:正确识别并酶切的效率
3
。加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。
(责任编辑:大汉昆仑王)