设计引物时酶切位点的保护碱基一定要在两侧加吗，酶切后的残留碱基要添加保护碱基使之是3的倍数吗？

设计保护碱基一般是2-3个就可以，主要为了平衡primer的GC含量

1.在设计引物时，一般考虑在酶切位点的两侧加入保护碱基。这样可以避免非特异性酶切，提高引物的特异性。

2.在酶切后的残留碱基上添加保护碱基并不是必须的，但是添加3'或5'端的保护碱基可以增加引物的稳定性。

3.Sal1, AflII, AgeI, HpaI 是四种常用的酶，它们的保护碱基一般是G/C和A/T。

Sal1 保护碱基是 G/C

AflII 保护碱基是 A/T

AgeI 保护碱基是 G/C

HpaI 保护碱基是 C/G

这些保护碱基是酶切位点的共同特点，在设计引物时需要避免这些位置。

设计引物时酶切位点的保护碱基要在两侧加。

可以去NEB官网搜索或者直接百度搜索限制性内切酶保护性碱基，有详细的每一种内切酶的保护性碱基