我设计的引物为：上游引物：TCC CCCGGG ATGGCTCCACTTCACGAATC下游引物：ATAAGAAT GCGGCC

Miracle星

2022-06-10

我设计的引物为：上游引物：TCC CCCGGG ATGGCTCCACTTCACGAATC下游引物：ATAAGAAT GCGGCCGC TTATTAAAAGGTGAAAGAC酶切序列是SmaI（CCC GGG）与NotI（GC GGCCGC）。前面的保护碱基是选择切割率比较大的保护碱基，但是这对引物的GC含量相差比较大（上游貌似60%+，下游只有40%），而且Tm值也有点差距..具体数据我记不清楚了..这台电脑上木有..而且会形成二聚体、错误引发情况以及上下游引物之间的二聚体形成情况。怎么处理这样的矛盾...忘哪方面考虑去处理？

3 个回答

bamboopiggy

2022-06-11

有帮助

你能不能换个酶？你选的这两个酶，全是GC的，本身就会导致TM值升高，再加上上游起始序列中GC含量也比较高，所以你换个酶比较合适。

天一湖医者

2022-06-10

有帮助

查看你的引物的形成二聚体，错配，cross dimer的△G的值是多少，如果大于-4.5，那么问题不大，另外看是不是3‘端形成了错配等，如果有，能够修改引物长度最好。△G最好不要超过两位数。

2.Tm值有差距一般调节引物长度。短的引物总归Tm值相对低。另外，退火的时候酶切位点那一段是不算的哦！他们不结合在链上，楼主这点注意（从你算得60%看你肯定是把前面的酶切位点也算进去了）

3.如果引物位置比较灵活的话换一下引物的位置，不过如果是P一段完整基因的话就算了。
4.我连分数60多的引物都P出来过，如果你一定要P出来的话，不要太相信电脑的数据，试试看。
5.如果引物还是不好，做的时候可以考虑用热启动降落PCR方法。如果有弥散，建议降低镁离子量和dNTP的量。浓度低就拿第一次PCR引物回收后再去做一次PCR。

Eason老歌迷

2022-06-10

有帮助

引物的设计有几个重要的原则。不知道你参考了吗？引物3′端要避开密码子的第3位，引物3′端不能选择A，最好选择T，碱基要随机分布，引物自身及引物之间不应存在互补序列，引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰，扩增产物的单链不能形成二级结构。