请问怎么两条DNA链杂交，怎么模拟二级结构，计算自由能呀？

你习惯用什么软件设计引物？一般设计引物的软件都可以模拟，例如vector NT，或者snapgene

有很多设计引物的软件可以做这个，比如premier

伍老师这篇文章讲的很详细，你可以看看，”碱基对在DNA双螺旋链上分离的自由能计算”。