Western Blot Protocol实验步骤

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一、提取抗原 蛋白
将提取RNA途中留存的样品，加入150μl100%酒精充分混匀，静置5min(RT),2000×g,4℃离心5min,吸取上清至新管中,加入750μl异丙醇,混匀,静置10min(RT),12000×g,4℃离心10min,弃上清,加入1ml0.3mol/L盐酸胍/95%酒精重悬沉淀,用加样器打散沉淀,混旋20~30秒,静置20min(RT),7500×g,4℃离心5min,弃上清,重新加入1ml0.3mol/L盐酸胍/95%酒精两次,重悬沉淀,离心后弃上清,加入100%无水乙醇1ml,混旋1min,静置20min(RT),7500×g,4℃离心5min,弃上清,真空干燥5min,50μl1%SDS溶解沉淀，用50℃热水助溶，直至全部溶解。10000×g,离心10min,去除沉渣。
二、蛋白定量
1.取PBS 、各样品10ul，加DW990ul
2.取DW匀浆缓冲液、样品稀释液、系列牛血清白蛋白标准浓度0.5ml。
3.向各管加入2.5mlD试剂（A50ml＋B0.5ml＋C0.5mlA－2%Na2CO3、0.1NNaOH，B－0.5%CuSO4，C－1%酒石酸钠）混匀，静置10分钟。
4.迅速加入酚试剂0.25ml，混匀37℃水浴30分钟。
5.721分光光度计650nm，比色，S0标准管调零。
6.最后稀释为4ug/ul，加载样缓冲液后，终浓度为2ug/ul，上样量为30～80ug/泳道。
三、电泳
1.makegel．

11%分离胶 12ml 两块胶

4%积层胶6ml两块胶

DW 4.36 ml

DW 堵漏 3.66ml

3M Tris 3.0 ml

0.5M Tris 1.5 ml

30%Arc 4.4 ml

30%Arc 0.5 ml 0.78 ml

10%SDS 0.24 ml

10%SDS 60 ul

10%APS 0.12 ml

10%APS 20ul 30 ul

TEMED 10ul

TEMED 5ul 6ul

2.上样前样品处理：
样品100℃、3分钟、冷却，900×g、离心30S。
3.通电电：积层胶电泳电压50V左右，分离胶电泳电压90～110V。
4.考马斯亮蓝染色：1小时，1号脱色1小时，2号脱色2小时。
四、电转印
1.将滤纸NcM切成与凝胶尺寸大小，置于DM中浸透5分钟，电转液平衡15分钟。
2.转移：用二张大滤纸贴于两张多孔垫料，将NcM、胶夹于中间，在NcM与大滤纸之间垫小滤纸。NcM朝正极，20V恒压转移12小时。取下NcM杂交，凝胶染色看效果。
五、杂交
1.取下NcM，做好标记，dH2O冲洗，室温滤纸干或放入膜固定液15分钟。
2.NcM用PBS冲洗二遍，呈5～6%non－fatmilk的pH7.2的PBS中封闭，室温６－８小时或室温1－2小时，4℃，过夜。
3.将封闭的膜用ＰＢＳ冲洗一遍，洗15分钟×1，5分钟×2。
4.加入一抗1:1000－1200，室温，反应1小时
5.PBS洗15分钟×1，15分钟×4。
6.加入二抗1:5000，室温，反应1小时。
7.PBS洗15分钟×1，5分钟×4。
六、化学发光试剂检测
1.混合等体积Bottle1&2与NcM共孵育1分钟。
2.放射自显影：曝光3分钟至10分钟。
3.显影后清水漂洗，再定影。
七、所用试剂
1、匀浆缓冲液4×1L：

 

NaH2PO4（·H2O）

12.48g

Na2PO4·12H2O

114.6g

NaCl

3.6g

dw 800ml, adjust pH to 7.0, adjust Vol to 1 L

（1）用时稀释4倍。
（2）40ml PBS＋PMSF 40 ul＋1.10 phenautehroline 80 ul＋Iodo 80ul＋pepstalmA 80ul
2. 系列牛血清蛋白浓度稀释法：
取500ug / ml BSA按下法配制：

 

 

500ug / ml BSA

NS

蛋白浓度ug / ml

S1

50 ul

1.95 ml

12.5

S2

100 ul

1.90 ml

25

S3

200 ul

1.80 ml

50

S4

400 ul

1.60 ml

100

S5

800 ul

1.20 ml

200