【原创】Western Blot实验步骤
丁香园
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一直感觉园子里针对Western Blot实验的帖子很多，最近浏览了一下蛋白实验的论坛，看到还是有很多同学遇到各种各样的问题，我就把我们实验室比较成熟的Western Blot实验步骤整理了一下，也挂出来供大家参考一下，希望对您的实验有帮助。
实验步骤：
1.分别配制 5%浓缩胶和12%分离胶
12%分离胶10mL 5%积层胶6mL
H2O 3.3mL H2O 4.20mL
30% Acrylamide 4mL 30% Acrylamide 1mL
pH8.8 Tris HCl（1.5M） 2.5mL PH6.8Tris HCl（1M） 0.76mL
10%APS 100uL 10%APS 60uL
10%SDS 100uL 10%SDS 60uL
TEMED 7.6uL TEMED 6uL
分离胶：分离胶配制完毕即可进行灌胶，灌胶结束后使用ddH2O进行液封。当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已经凝好。（一般要等1.5h）
积层胶：倒掉分离胶上层的水并用吸水纸吸干，配制积层胶并进行灌胶，插入梳子。积层胶凝固完全后拔掉梳子，准备上样电泳。（一般凝固0.5h以上）
2.电泳：
上样顺序如下：
细胞裂解液15ul 细胞裂解液15ul 预染蛋白Marker 10uL 细胞裂解液15ul 细胞裂解液15ul
电泳条件：90V 1.5h 。
3.转印：
电泳结束后，取出胶，剪相应大小的一张硝酸纤维素膜和六张滤纸，将胶、膜、滤纸和海绵放入转印缓冲液中浸透，取夹子，按照“海绵—三层滤纸—胶—硝酸纤维素膜—三层滤纸—海绵”的顺序安装好，每一步都要避免产生气泡，放入转印装置中，使胶靠近负极，膜靠近正极。
转印条件：90mA， 90min。
4.封闭：
膜片置于封闭液（PBS / 5%脱脂奶粉）中，4℃过夜封闭。
取出膜PBST洗三次，每次洗 5 min。
5.一抗孵育：
稀释液为1%的PBS脱脂奶粉
一抗（鼠抗）稀释500倍（说明书上为500-1000倍）。70r/min，室温孵育3h。
PBST洗3次，每次8 min。
6.二抗孵育：
稀释液为1%的PBS脱脂奶粉
使用AP标记的羊抗小鼠的二抗，稀释约30000倍。70r/min，室温孵育2h。
PBST洗3次，每次8 min。
7.显色
按照以下配方配制NBT/BCIP显色液：
NBT原液：NBT 40mg 加0.7％的DMF 1.2mL混匀，4℃避光保存(用铝箔包裹)；
对照、待测NBT，各配一组。
BCIP原液：BCIP 20mg加100％的DMF 1.2mL混匀，4℃避光保存(用铝箔包裹)。
显色缓冲液：0.1M Tris HCl ，0.1M NaCl ，50mM MgCl2，pH 9. 5。
使用时BCIP和NBT各10uL加在1mL缓冲液中，EP管中混匀，滴到膜上，避光处显色，5~10分钟。见条带后，水洗，中止显色。
如果是DAB显示的话，其他步骤一样，就是最后一步显示，按照DAB显示试剂盒要求操作就可以了。
实验步骤：
1.分别配制 5%浓缩胶和12%分离胶
12%分离胶10mL 5%积层胶6mL
H2O 3.3mL H2O 4.20mL
30% Acrylamide 4mL 30% Acrylamide 1mL
pH8.8 Tris HCl（1.5M） 2.5mL PH6.8Tris HCl（1M） 0.76mL
10%APS 100uL 10%APS 60uL
10%SDS 100uL 10%SDS 60uL
TEMED 7.6uL TEMED 6uL
分离胶：分离胶配制完毕即可进行灌胶，灌胶结束后使用ddH2O进行液封。当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已经凝好。（一般要等1.5h）
积层胶：倒掉分离胶上层的水并用吸水纸吸干，配制积层胶并进行灌胶，插入梳子。积层胶凝固完全后拔掉梳子，准备上样电泳。（一般凝固0.5h以上）
2.电泳：
上样顺序如下：
细胞裂解液15ul 细胞裂解液15ul 预染蛋白Marker 10uL 细胞裂解液15ul 细胞裂解液15ul
电泳条件：90V 1.5h 。
3.转印：
电泳结束后，取出胶，剪相应大小的一张硝酸纤维素膜和六张滤纸，将胶、膜、滤纸和海绵放入转印缓冲液中浸透，取夹子，按照“海绵—三层滤纸—胶—硝酸纤维素膜—三层滤纸—海绵”的顺序安装好，每一步都要避免产生气泡，放入转印装置中，使胶靠近负极，膜靠近正极。
转印条件：90mA， 90min。
4.封闭：
膜片置于封闭液（PBS / 5%脱脂奶粉）中，4℃过夜封闭。
取出膜PBST洗三次，每次洗 5 min。
5.一抗孵育：
稀释液为1%的PBS脱脂奶粉
一抗（鼠抗）稀释500倍（说明书上为500-1000倍）。70r/min，室温孵育3h。
PBST洗3次，每次8 min。
6.二抗孵育：
稀释液为1%的PBS脱脂奶粉
使用AP标记的羊抗小鼠的二抗，稀释约30000倍。70r/min，室温孵育2h。
PBST洗3次，每次8 min。
7.显色
按照以下配方配制NBT/BCIP显色液：
NBT原液：NBT 40mg 加0.7％的DMF 1.2mL混匀，4℃避光保存(用铝箔包裹)；
对照、待测NBT，各配一组。
BCIP原液：BCIP 20mg加100％的DMF 1.2mL混匀，4℃避光保存(用铝箔包裹)。
显色缓冲液：0.1M Tris HCl ，0.1M NaCl ，50mM MgCl2，pH 9. 5。
使用时BCIP和NBT各10uL加在1mL缓冲液中，EP管中混匀，滴到膜上，避光处显色，5~10分钟。见条带后，水洗，中止显色。
如果是DAB显示的话，其他步骤一样，就是最后一步显示，按照DAB显示试剂盒要求操作就可以了。
