简介
在细胞标记之前，将细胞分散为单个细胞悬液。每个细胞的样品应分为两份，一份与标记 PNA 探针共育，另外一份不标记的作为空白对照。如果细胞数量允许的话，推荐作 2 个复管或 3 个复管。每次试验进行对照细胞检测验证杂交过程非常重要。理想的方法是对照样本无论检测长的端粒还是短的端粒都必须与样品同时进行检测。Hultdin 等在每个样品检测时使用 1301 细胞系作为内参。这些永生化的细胞系有很长的端粒，并且易于和其他细胞相区分。当然其他细胞系也可以用作对照。我们实验室是使用 CCRF-CEM 细胞作为长端粒对照，而用 Jurkat 细胞来为短端粒的对照。每次试验，这些对照作为独立的样品检测，从而使得不同工作日进行的多个试验具有可比性。一旦对照细胞系确定，将同一批细胞分装冻存起来，为今后试验提供可靠的内参来源。
材料与仪器
器材：能加热到 40 ℃ 和 82 ℃ 水浴或金属浴装置、离心机、涡旋混合器、1.5 mL Eppendorf 离心管、一次性 12 mm × 75 mm 聚苯乙烯管、细胞计数器或血细胞计数仪、流式细胞仪等。
试剂：
① 磷酸盐缓冲液（PBS）不含 Ca2+ 和 Mg2+。
② 牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）。
③ QuantumTM 24 预混合的与可溶性荧光素分子相当的异硫氰酸荧光素（FITC MESF）珠（彭斯实验室，Fishers 公司；前流式细胞仪标准公司，圣胡安，波多黎各）。
④ 用于端粒重复序列检测的肽核酸荧光探针（peptide nucleic acid，PNA）：荧光素偶联的合成的特异性 PNA 探针（PerSeptive Biosystems，福雷明罕，马萨诸塞州；Boston probes，贝德福德，马萨诸塞州），或者购买试剂盒，端粒 PNA 试剂盒/FITC（DAKO 公司，卡平特里亚，加利福尼亚）。
⑤ 杂交缓冲液：70％ 甲酰胺，20 mM Tris-HCl，pH7.0，1％BSA，含有或不含有 0.3 μg/ml 的 PNA 探针。
⑥ 洗涤缓冲液：70％ 甲酰胺，20 mM Tris-HCl，pH7.0，1％ BSA，0.1％ 吐温-20。
⑦ 含 DNA 的重悬缓冲液：PBS，0.1％ BSA，碘化丙啶（propidium iodide，PI）0.06 μg/ml 其中含无 DNA 酶的 RNA 酶 A 10 μg/ml，或者 7-氨基放线菌素 D（7-aminoactinomycin D，7-AAD）0.01 μg/ml 其中不含 RNA 酶 A。
步骤
定量测定端粒长度的试验的基本过程可分为如下几步：
（一）定标和校正
目前用来标记端粒的 FISH 技术依赖于模仿端粒序列互补的特异性 DNA 序列合成的特异性肽探针。这些合成的探针上标记低分子量的荧光素，其可以通过流式细胞仪检测与端粒位点非共价结合的探针数对端粒进行定量。端粒重复序列特异性 PNA 探针的序列是 ［（CCCTAA）3-PNA］，这个序列已被证明对于 FISH 法测定端粒长度来说是非常可靠的。PNA 探针与传统的 cDNA 寡核苷酸探针相比有许多优越性，包括减少与 DNA 的非特异性结合，有抗核酸酶的功能以及与端粒序列结合强而稳定等特点。通过与 Southern blotting 数据相比较，根据经验确定的 PNA 探针与荧光及适当的端粒重复序列数结合的数学模式能适用于多种细胞中；然而，对于每台流式细胞仪和直接相关的某些内源性荧光值来说，定量每个端粒重复序列非共价结合的 PNA 探针数量需要进行校准和标准化。这样这些绝对的荧光值才可以换算成以 kbs 为单位的端粒长度。
A 标准化试验和 MESF 校准
为了弥补存在于流式细胞仪与日常属性（激光强度，组合的变化，等）误差，必须有一套标准化的校准程序来确保端粒长度定量测定的准确性。QuantumTM 24 预混荧光 MESF 珠常用来校准每台仪器和建立基于荧光测定的标准曲线。这些珠子表面结合的荧光素分子数量是已知的，可以用来校准流式细胞仪和确定的标准曲线。因此这些颗粒在流式细胞仪上的荧光强度值与实际的荧光素分子数相关联；如果偶联在 PNA 探针上的荧光素分子数量是已知的话，那么通过将相对荧光信号强度与每个细胞结合的 PNA 探针数量（即端粒重复序列数量）相关联就可以建立一条标准的荧光曲线。实例如图 22-1 和图 22-2 所示，流式细胞仪分析显示了未标记和标记 ［如 FITC 或藻红蛋白（PE）标记］ 的 MESF 珠混合物随着结合的大量荧光素分子逐渐增加而荧光强度不断增强。
① 调整未标记的珠在流式细胞仪荧光通道标尺数值的 1~10（4 个对数值的第 1 个 10 的对数值内）。
② 在同一个仪器设置下分析混合的不同荧光强度的 MESF 珠（图 22-1）。假设流式细胞仪检测器能够在整个动态过程中做出线性的测量，那么理想的情况下不同的 MESF 珠荧光强度荧光呈线性分布（图 22-2）。
③ 用以下线性回归方程式计算出 MESF 珠数量（MESF 值）与荧光通道上荧光强度数值（FLchannel 值）之间的线性关系：
FLchannel 值 - FLchannel 值（空白）＝ 斜率 × MESF 值
在端粒长度检测中，对每台流式细胞仪的检测器与所用的荧光素（如 PE）的线性关系进行评估是必要的。线性回归曲线的斜率如图 22-2 所示同样也随之被确定，并应用于端粒的长度的测定。理想的方法是每次 flow-FISH 检测时均应掺入 MESF 珠进行校准，从而确定仪器日常变异系数。
B 用转换曲线校准端粒的长度
① Rufer 等曾经计算对不同的淋巴细胞亚群采用 FITC 标记的 PNA 探针的 flow-FISH 方法测定端粒的荧光强度与 Southern blot 测定端粒长度之间的相关系数。这个相关系数适合于多种类型细胞的端粒长度测定。在这个系统中，对于流式细胞仪通道上的数值而言可以用下述方程对 FITC 荧光强度进行任意量化：
端粒的长度（kb）= 0.019 ×［FLchannel 值 - FLchannel 值（空白）］
② 随后 Rufer 等在采用之前所述的 FITC 标记的 MESF 珠校准 FITC 通道数值方法的研究中使用了一个更适合于定量的系统。把 MESF 珠的荧光强度值作为标准单位来取代任意量化的 FITC 通道荧光强度值，因此可用下列公式以 MESF 单位来表示由 Southern blot 检测到的端粒长度：
FLchannel 值 - FLchannel 值（空白）= MESF × 0.02604
③ 由公式 2 和 3 消除任意定化单位，可以推算出用标准 MESF 单位来表示端粒长度的最终表达式：
端粒的长度（kb）= MESF × 0.019 × 0.02604
假如校准所采用的是相同的标准化 MESF 珠，那么这个公式就不依赖于所采用的流式细胞仪。
④ 由公式 1 和 4 消除 MESF 单位，可以得出直接校准流式细胞仪 FITC 通道值，采用 flow-FISH 方法测定端粒长度计算公式：
端粒的长度（kb）＝
（FLchannel 值 - FLchannel 值 ［空白］）× 0.019 × 0.02604/斜率
（二）定量测定端粒长度
A 样品准备
① 用含 0.1％ BSA 的 PBS 洗涤细胞。
② 细胞计数，在 1.5 ml 的 Eppendorf 管中加入 0.5 × 106 个细胞数，500 g 离心沉淀细胞团块，去上清液。
③ 用含有 0.3 μg/ml 的探针（终浓度为 90 ng/样品）的杂交缓冲液 300 μl 重悬细胞团。相应的一管细胞不加 PNA 探针作为阴性对照。对于不同的探针准备和细胞来说对 PNA 探针的浓度进行滴定是必要的。
④ 将离心管置于 82 ℃ 的金属浴或水浴孵育 10 min。
⑤ 用涡旋振荡混匀样品，然后避光条件下室温孵育 2 h 或过夜杂交。
⑥ 用 1 ml 的洗涤缓冲液重悬细胞，混匀，40 ℃ 金属浴或水浴孵育 10 min。
⑦ 500 g 离心 7 min，去上清重复步骤 6。
⑧ 加入 500 μl 含 DNA 染料的重悬缓冲液重悬细胞。将细胞悬液转移到标准的 12 mm × 75 mm 聚苯乙烯管中，室温孵育 2~4 h。
⑨ 用流式细胞仪分析细胞。
B 流式细胞术
试验开始和结束时都必须检查流式细胞仪的校准和线性设置。
① 在上细胞样品前，先将荧光 MESF 珠上机，按照小标题「（一）定标和校正」第 A 步骤所述建立荧光标准曲线。
② 分析样品，保持 FITC 探测器（通常设定为 FL1）的电压设置与 MESF 珠定标时相同设置。开始，用前向散射（FSC）和 DNA 染料荧光来观察细胞，2 个坐标均采用线性标尺（图 22-3A）。对于 PI 和 7-AAD 荧光，通常采用长波红色荧光探测器检测。FSC 和 DNA 染料荧光检测探测器的电压设置可以与 MESF 珠定标时有所改变。所有的荧光补偿都应该置为零。
③ 针对处于 G0/G1，期的细胞设门，把门内这群细胞的 FITC 的荧光用柱状图来表示出来（见图 22-3B）。
④ 用表格式文件记录数据，其中包括在设定参数条件下 FSC（线性），DNA 染料（线性）和 PNA 探针荧光（对数）的数值。
C 数据分析
① 在这个流式细胞仪检测中 MESF 珠总量与 FITC 通道荧光值之间的线性回归关系可以用方程 1 来计算：
FLchannel 值 - FLchannel 值（空白）＝ 斜率 × MESF 值
② 按照副标题（二）定量测定端粒长度步骤 B（图 22-3A）所描述的用 FSC 和 PI 或 7-AAD 对 G0/G1，期单个细胞群体设门，在门内对 FITC 直方图展示 FITC 标记的 PNA 探针的荧光值（图 22-3B）。
③ 记录 PNA 探针和对照样品的平均荧光强度（MFI）。
④ 从 PNA 探针标记细胞的 MFI 中扣除空白对照的 MFI。
⑤ 端粒的长度就可以通过方程 5 从 MSEF 标准曲线中计算得到：
端粒长度（kb）＝
（FLchannel 值-FLchannel 值 ［空白］）× 0.019 × 0.02604/斜率
D 检测人初始 CD4 和记忆性 T 细胞端粒长度的数据举例
端粒长度检测一个非常有用的实例就是检测从正常人外周血单个核细胞（peripheralblood mononuclear cells，PBMCs）分离的初始 T 细胞和记忆 T 细胞的端粒长度。记忆性 T 细胞端粒的长度预期要比初始 T 细胞更短。试验结果如图 22-4 所示，Jurkat 细胞和 CCRF-CEM 细胞系同时分别作为短端粒粒和长端粒的对照，CD4+ 初始 T 与记忆性 T 细胞是来源于某个供体通过基于细胞表面表达的 CD4 和是否具有记忆性细胞表面标记 CD45RO 的荧光激活细胞分选获得的，结果如图 22-4 所示，5 个独立的试验使用同一群细胞。从 SD 值可见实验的每次重复实验的重复性很好，初始 T 细胞与记忆性 T 细胞端粒长度的差异的显著性很容易通过 T-检验来分析，P = 0.018（n = 5）。
来源：丁香实验
