丁香实验_LOGO
登录
提问
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

相互作用蛋白捕获

相关实验:相互作用蛋白鉴定实验

最新修订时间:

原理

实验要经过两次连续大量的酵母菌平板筛选过程。酵母菌含有 LexA 融合探针、报道基因和插入PJG4-5(见图19.1.6)的 GAL 启动子控制下的 cDNA 表达文库。最近,已有可供用于这个系统的文库。

材料与仪器

携带适当质粒组合的酵母菌
完全(CM)缺失成分液体培养基 含有如下指示剂的糖
30℃ 培养箱 低速离心机和转子 50 ml 锥形试管 无菌 1.5 ml 微量离心管 无菌 42℃ 加热板 无菌玻璃显微镜载玻片

步骤

实验材料、试剂的准备请见「其他」。


1. 将约 20 ml 含 LexA-操纵子-lacZ 表达质粒和 pBait 的酵母菌 EGY 48 或 EGY 191 培养液接种到 Glu/CM-Ura、-His 缺失成分液体培养基中,于 30℃ 培养过夜。


2. 将培养液稀释到 300 ml Glu/CM-Ura、-His 缺失成分液体培养基中至浓度约为 2×106 细胞/ml(OD600 约 0. 10),于 30℃ 培养直至培养液密度约为 1 × 107 细胞/ml(OD600 约 0. 50)。


3. 室温下以 1000~1500 g 在低速离心机中离心 5 min,收集酵母菌细胞。菌体重悬在 30 ml 无菌水中,并移至 50 ml 锥形离心管中。


4. 以 1000~1500 g 离心 5 min,弃上清,菌体用 1.5 ml TE/0.1 mol/L 乙酸锂重悬。


5. 取 30 个微量离心管分别加 1 μg 的插入文库 DNA 的 pJG4-5 质粒和 50 μg 高纯度的剪切均匀的鲑精载体 DNA,然后分别加入 50μl 从步骤 4 获得的重悬酵母菌液。

加入的文库和鲑精 DNA 的总体积应小于 20μl,最好小于 10μl。一个典型的文库转化将获得 2~ 3 ×106 个原代转化子。这一转化总共需要 20~30 μg 文库 DNA 和 1~2 mg 载体 DNA。


6. 分别加入 300 μl 40% pEG 4000/0.1 mol/L 乙酸锂/TE 缓冲液,pH 7.5,颠倒混合直至完全混匀,于 30℃ 温育 30 min。


7. 加入 DMSO 至终浓度 10%(每管约 40 μl),颠倒混匀,在 42℃ 加热板上热激 10 min。


8.1 取其中 28 管:每管涂布一块 24 cm×24 cm Glu/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培养基平板,于 30℃ 培养。


8.2 剩余的 2 管:每管取 360μl 涂布在 24 cm × 24 cm Glu/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培养基平板上。剩余的 40 μl 用无菌水作 1 : 10 的分别等比稀释,再取稀释液 分别涂布在 100 mm Glu/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培养基平板上,将所有平板置于 30℃ 培养 2~3 天直至菌落出现。

系列稀释将给出一个大约转化的效率,由此可估算所获转化子的值。


9. 将所有生长转化子的 24 cm×24 cm 平板在 4℃ 下冷却数小时,使琼脂变硬。


10. 戴上手套,使用无菌玻璃显微镜载玻片,轻轻地从平板上将酵母菌细胞刮下来。将 30 个平板上刮下来的细胞收集到 1 或 2 支 50 ml 无菌的锥形试管中。


11. 用 1 体积或至少与转移细胞体积相等的无菌 TE 缓冲液或水洗涤细胞,室温下以 1000~1500 g 离心 5 min,弃上清后重复洗涤 1 次。


12. 用 1 体积的甘油溶液重悬沉淀的酵母菌细胞,混匀后分装成每份 1 ml,于 -70℃ 可保存 1 年。


13. 复活酵母细胞时,用 Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培养基将一份冻存的转化酵母细胞作 10 倍稀释,于 30℃ 摇床温育 4 h,诱导文库上的 GAL 启动子。


14. 接着用 Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培养基系列稀释酵母菌细胞。涂布在 100 mm Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培养基平板上,于 30℃ 培养 2~3 天至长出可见的菌落。


15. 计算菌落数,推算出每一等份被转化的酵母菌的菌落形成单位(cfu)数。


16. 基于铺板效率解冻适当数量的转化酵母菌,按照步骤 13 稀释,培养。为了获得 107 细胞/ml 的浓度(OD600 约等于 0.5),按需要将转化酵母菌培养液稀释到 Gal/ Raff/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu 缺失成分培养液中。按总转化子数计算所需的平板数,并以每平板 100 μl 涂布在 100 mm Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu 缺 失成分培养基平板上。于 30℃ 培养 2~3 天直至菌落出现。


17. 小心地挑取适当的菌落接种到一个新鲜的 Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu 缺失成分培养基主平板上,于 30℃ 培养 2~7 天至菌落出现。

挑出在第 2 天长出的菌落接种到一个主平板上,第 3 天长出的菌落接种到一个第二主平板上,而 第 4 天长出的菌落接种到一个第三主平板上。如果获得了许多明显的阳性菌落,那么用在第 4 天(及以后数天)可能获得更大数目的菌落制备主平板。


18. 再从 Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu 缺失成分培养基主平板上挑菌落转至 100 mm Glu/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培养基主平板上,于 30℃ 过夜培养至菌落形成。


19. 从这个主平板上挑菌划线或影印在以下平板上:

Glu/X-gal/CM-Ura、-His、-Trp

Gal/Raff/X-gal/CM-Ura、-His、-Trp

Glu/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu

Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu

这个时候,如果菌落在 Gal/Raff/X-gal 平板上呈蓝色但在 Glu/X-gal 平板上不变蓝或仅呈很弱的蓝色,并且菌落在 Gal/Raff/CM-Leu 平板上生长而不能在 Glu/CM-Leu 平板上生长,那么所获得的菌落和文库质粒可暂定为阳性。


以下步骤用以测定 Leu +插入的 Gal 依赖和 lacZ 表型来证实这是因为文库编码蛋白表达的结果。在诱导之前关闭了 GAL1 启动子并排除了 -Leu 选择。


20.1 按直接电穿孔方案将酵母菌质粒直接转移到 E.coli 中,接步骤 22。


20.2 通过快速小量制备方案从酵母菌中分离质粒 DNA,并作以下修改:获得水相后,加入乙酸钠(NaAc)至终浓度 0.3 mol/L 和 2 体积的无水乙醇,置冰浴 20 min,以最大速度微量离心 15 min,用 70% 乙醇洗涤沉淀,干燥后用 5 μl TE 缓冲液溶解沉淀。


21. 用 1 μl DNA 电穿孔到 KC 8 细菌中,放置在 LB/氨苄平板上,37℃ 过夜。


22. 划线或复制 LB/氨苄平板上的克隆到细菌确定的极限 A 培养基平板含有维生素 B1 和 Ura、His、Leu,而无 Trp。37℃ 过夜。


23. 用细菌小量制备方案纯化文库质粒。这个阶段不要对获得的 DNA 测序,因为可能分离到的克隆没有相互作用。在完成特异试验后再测序。

因为多种 2 μm 带有相同标志质粒可以在酵母中同时存在,一个单独的酵母有时含有两个或更多不同的文库质粒,而只有其中的一种编码相互作用蛋白。对于每一种酵母菌阳性克隆应至少排选 两个单独的细菌转化子,采用 EfoRI 和 Xhol 消化产生 cDNA 插入片段,并进行琼脂糖微胶电泳来验证两个质粒是否含有相同的插入片段。


24. 在不同的转化实验中,用从步骤 23 纯化的质粒转化已含有下列质粒并生长在 Glu/ CM-Ura、-His 平板上的酵母菌:

含 pSH18-34 和 pBait 的 EGY48

含 pSH18-34 和 pRFHM-1 的 EGY48

含 pSH18-34 和非特异性诱饵蛋白质粒的 EGY48(可选)


25. 将每一种转化混合物涂布在 Glu/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培养基平板上,于 30℃ 培养 2 到 3 天直到菌落长出。


26. 对每个待验证的文库质粒均涂布一个 Glu/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培养基的主平板。即从每个转化平板上挑 5 或 6 个单独的菌落接种到 Glu/CM-Ura、-His、-Trp 平板上,于 30℃ 过夜培养。


27. 从这种缺失成分主平板上挑菌或影印菌落至实际筛选中所用的同一系列的验证平板上:

Glu/X-gal/CM-Ura、-His、-Trp

Gal/Raff/X-gal/CM-Ura、-His、-Trp

Glu/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu

Gal/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu

一旦细胞中含有 LexA 诱饵蛋白,真正的阳性 cDNA 应使细胞在 Gal/Raff/X-gal 平板上呈蓝色但在 Glu/X-gal 平板上不变蓝,而且应能使细胞在 Gal/Raff/CM-Leu 缺失成分平板上生长但不能在 Glu/CM-Leu 缺失成分平板上生长。符合这种标准的 cDNA 即可进行测序(见图 19.1.3 说明中的引物序列)或进行特性分析。那些编码与 RPHF-1 或另一种非特异性的诱饵蛋白相互作用蛋白的 cDNA 应该丢弃。

从 cDNA 数据库中对照查询被认为是假阳性的分离 cDNA 也许是有益的。


28. 如果条件合适,可进行另外的特异性验证实验。对阳性分离子进行分析并测序。

用于 PJG4-5 的引物序列在图 19.1.4 中图注中列出。从 KC8 制备的 DNA 即使在用 Qiagen 柱或氯化铯梯度纯化后一般仍不适于进行双脱氧或自动测序。待测序的文库质粒在测序前应该用从 KC8 小量制备的质粒转化一种更适于测序的菌株,如 DH 5a。

注意事项

1. 所有溶液和与细胞接触的仪器都必须是无菌的,而且操作时应采用适当的无菌技术。


2. 加入的文库和鲑精 DNA 的总体积应小于 20μl,最好小于 10μl。一个典型的文库转化将获得 2~ 3 ×106 个原代转化子。这一转化总共需要 20~30 μg 文库 DNA 和 1~2 mg 载体 DNA。

常见问题

携带适当质粒组合(见表 19.1.1 和表 19.1.2)的酵母菌:

含 LexA-操纵子-lacZ 报道质粒和 pBait 的 EGY48

含 LexA-操纵子-lacZ 报道质粒和 pRFHM-1 的 EGY48

含 LexA-操纵子-lacZ 报道质粒和任一非特异性诱饵蛋白质粒的 EGY48


完全(CM)缺失成分液体培养基,含有如下指示剂的糖 [葡萄糖、半乳糖和(或)棉籽糖][2% (m/V) Glu 或 2% (m/V) Gal + 1% (m/V) Raff(棉籽糖)]:

Glu/CM-Ura、-His

Glu/CM-Trp

Gal/Raff/CM -Ura, -His、-Trp


无菌水

TE 缓冲液(pH 7.5)/0.1 mol/L 乙酸锂

克隆于 PJG4-5 质粒的文库 DNA(见表 19.1.3,图 19.1.6)

高纯度剪切均匀的鲑精 DNA

40% (TTI/V) PEG 4000(过滤除菌)/0.1 mol/L 乙酸锂/TE 缓冲液(pH 7.5)

二甲基亚砜(DMSO)


完全(CM)缺失成分培养基平板,含有如下指示的(20 mg/ml)X-gal 和糖 [2% (m/V) Glu, 2% (m/V) Gal+1 % (m/V) Raff(棉籽糖)]:

Glu/CM-Ura、-His、-Trp,24 cm × 24 cm(Nunc)和 100 mm

Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp,100 mm

Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp、 -Leu,100 mm

Glu/X-gal/CM-Ura、-His、-Trp,100 mm

Gal/Raff/X-gal/CM-Ura、-His、-Trp,100 mm

Glu/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu,100 mm

Glu/CM-Ura、-His,100mm

Gal/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu,100mm


TE 缓冲液,pH 7.5 无菌(选用)

甘油溶液

E.coli KC 8 株

E.coli DH 5a 或其他可用于制备供测序用 DNA 的株系

LB/氨苄青霉素平板

细菌确定的极限 A 培养基平板:1×A 平板添加 0.5 μg/ml 维生素 B1,再分别添加 40 μg/ml Ura、His 和 Leu

来源:丁香实验

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序