鉴定诱饵蛋白（LacZ 的活性分析）

捕捉相互作用蛋白的第一步是构建能够表达 LexA 与目的蛋白的融合体的质粒。这种质粒转化到包含 LEU2 和lacZ 报道基因的报道酵母株中，并要行一系列的对照实验来鉴定所构建的诱饵蛋白是否适用，是否需要修饰，或是否应改变酵母菌报道条件。这些对照实验实现了诱饵蛋白在酵母菌中作为一种稳定蛋白质合成、可进入细胞核并与 LexA 操纵子位点结合、不激活基于 LexA 操纵子的报道基因的转录。LexA 融合的诱饵蛋白必须是不能激活其他报道基因转录的在 EGY 48 株（或者相关的 EGY 191）中表达 LexA 融合蛋白不能在缺失 Leu 的培养基上生长，并且在含有 X-gal 的培养基上生长 的克隆是白色的。这种典型的诱饵蛋白质粒被用于在「相互作用蛋白捕获」 中筛选文库中的相互作用蛋白。

1. 应用标准的亚克隆技术（图 19.1.3），把编码目的蛋白的 DNA 插入到 pEG202（见图 19.1.3）或别的 LexA 融合质粒中，建立融合蛋白读框。

2. 把以下三组质粒分别用酸锂法转化到 EGY 48 中

pBait+pSH18-34（实验）

pSH17-4+pSH18-34（阳性对照）

pRFHM1+pSH18-34（阴性对照）

3. 把每个转化混合物放置在 Glu/CM-Ura、-His 缺失平板上。在 30℃ 孵育两天，挑选包含双质粒的酵母。

4. 步骤 3 中每组挑选 5 或 6 个独立的克隆，在 Glu/CM-Ura、-His 缺失主平板上划线，30℃ 过夜。

5. 制备 Z 缓冲液 X-gal 平板。

6. 从主平板上挑菌落划线于 X-gal 平板，并于 30℃ 培养。

7. 在接下来的 2~3 天内定期观察平板颜色的变化。

LexA 融合蛋白不能激活转录，通过抑制实验证实 LexA 融合蛋白在酵母中正处于合成状态（有些蛋白质没有合成）并且能够结合 LexA 操作子序列（图 19.1.5）。 接下来的步骤能够同时和激活分析实验同时进行。

8. 将以下组合的质粒分别转化酵母菌 EGY48（三组转化实验）：

pBait+ pJK101（实验组）

pRFHM1 + pJK101（阻遏作用阳性对照组）

pJK101 单一质粒（阻遏作用阴性对照）

9. 将每一种转化混合物涂布于 Glu/CM-Ura、-His，或 Glu/CM-Ura 缺失成分培养基平板上，以便适于选择带有指示质粒的酵母菌细胞。30℃ 培养 2~3 天直至菌落出现。

10. 将菌落划线在 Glu/CM-Ura、-His，或 Glu/CM-Ura 缺失成分主平板上，并于 30℃ 培养过夜。

11. 通过液体测定（采用 Gal/CM 缺失成分液体培养基），平板测定（步骤 2.5~2.7，采用 Gal/ CM-Ura X-gal 平板）来检测 3 组转化酵母菌株中的 β-半乳糖苷酶活性（实验组、阴性对照组、阳性对照组）。采用滤膜测定 1~2 h；采用 X-gal 平板 24~36 h。

12. 如果诱饵蛋白既不能激活也不能阻遏转录，那么应通过抗 LexA 抗体或抗实验中合成蛋白的融合结构域的抗体对粗制裂解物进行免疫印迹分析检测蛋白质合成。这些步骤可以与lacZ 激活实验和抑制分析同时进行。

13. 取一个转化了 pBait 和 pSH18-34 报道质粒的 EGY48 酵母菌单菌落，分散于 500 μl 无菌水中。取出其中 100 μl 稀释于 1 ml 无菌水，并用无菌水作 1:10 的连续稀释至 1000 倍。

14. 从每一个稀释浓度试管（包括未稀释的 10 倍、100 倍和 1000 倍稀释的试管）中各取 100 分别涂布 Gal/CM -Ura、-His 缺失成分培养基平板和 Gal/CM -Ura、-His、-Leu 缺失成分培养基平板，于 30℃ 培养过夜。

在相互作用子捕获实验中实际上是依据诱饵蛋白和酸性融合成对激活 LexA 操纵子-LEU2 基因转录并允许在 Leu-的培养基上生长的能力来进行选择的，而不是单独的诱饵蛋白本身。因此，Leu 需求测试是判断诱饵蛋白是否可能有一个不切实际的高背景的最重要测试。对某些诱饵蛋白而言，EGY 48 中的 LEU2 报道蛋白比 pSH 18-34 报道蛋白更加敏感，因此诱饵蛋白在β-半乳糖苷酶 分析中只有很少或完全没有信号，然而却有些菌可能在 Leu 培养基上生长。如果这种情况发生，有几种操作可以选择，最直接的方法是用一个较不敏感的筛选株 EGY191 替代，然后重复分析。

所有溶液和与细胞接触的仪器都必须是无菌的，而且操作时应采用适当的无菌技术。