方案11 蛋白质阵列：标记蛋白并通过阵列检测来探究蛋白质-蛋白质相互作用

一、蛋白标记

1.将染料溶人 250ul 水中，每 10ug 待标记蛋白中，加入 5ul 的染料溶液。蛋白质浓度不能低于 100 ug/ml。

在这样的条件下，蛋白质被标记的程度与蛋白质浓度无密切关系。虽然制造商推荐标记时的 pH 值为 9.3，但一般都在 pH 值为 7.5 的 PBS 缓冲液中进行标记。低 pH 有利于染料和蛋白质的氨基末端相连，而高 pH 值则导致染料与赖氨酸残基发生非选择性的掺人。

2.将染料和蛋白质的混合液在室温条件下孵育 30 min，使染料和蛋白质分子充分反应。

3.加入 0.1 倍体积含有 500rnmol/L 甘氨酸（pH8.0) 的 PBS 终止反应，在室温条件下再游育反应管 30 min。

4.用层析法或透析法除去未掺入蛋白中的染料。

若蛋白带有亲和标记（如 His6-标记或 GST-标记），用亲和层析方法，可以很方便地除去未发生掺人的染料。

二、用探针标记阵列

5.将探针缓冲液和被荧光标记的蛋白质混合后，制成探针溶液。

探针缓冲液的组分决定于被标记的蛋白质。通常缓冲液中应含有盐、去污剂和 BSA。以尽可能地避免非特异性反应的发生。另外，缓冲液中应含有还原剂、金属离子或所需的其他因子。一开始，建议使用含有 0.1% Tween-20(体积分数）和 0.O1mg/ml BSA 的 PBS(pH7.5)。被标记蛋白的最佳浓度，因不同的实验而各不相同。开始时可先采用 1ug/ml，这对约 50kDa 的蛋白质来说相当于 20nmol/L。

所用缓冲液的体积由具体实验而定。蛋白质浓度范围可从 1nmol/L~1umol/L。

6.用带有荧光标记的蛋白质作为探针标记蛋白阵列。

单阵列玻片操作方法

（1）将 CoverWell 玻片孵育箱放在桌子上，有衬垫的一面朝上。

（2）加入 550^1 探针标记溶液。

（3）将微阵列玻片慢慢沉下，置于 CoverWell 上方，带有阵列的一面朝下。

（4）插入玻片并轻轻压好玻片，注意要让 CoverWell 牢牢地封住玻片。

若操作正确得当，溶液会漫过玻片表面，且不会产生气泡。

多阵列玻片操作方法

（1）对每个阵列来说，在玻片正确的一面，加上 10?30 沁的标记蛋白。不要用盖玻片或 CoverWell 覆盖阵列。

（2）将玻片放入一个保湿器中。

7.在室温条件下，孵育玻片 lh。

8.用 PBST 将玻片轻微冲洗后，再用 PBST 把玻片冲洗 3 遍，每次 2~3 min。

9.用 PBS(没有 Tween-20 的）将玻片轻微冲洗后，用一配置有可放置玻片转子的离心机，在 200 g 条件下离心 30s，以去除残留的缓冲液。

若没有合适的转子配置，也可以采用通氮气流的方法来干燥玻片。

10.用荧光玻片扫描仪检测玻片的成像（参见「10.8.4 阅读和解析蛋白质陈列）。