蛋白质微阵列技术

微阵列技术在单个实验中能同时分析数千个参数。捕获分子微点在固体支持物上固定成行列并暴露在含相应结合分子的样品中。基于荧光、化学发光、质谱、放射性或电化学的读出系统能检测每个微点形成的复合物。

这些微小化和平行的结合分析高度灵敏，方法的分析能力又能被微阵列基因表达分析所放大。在这些系统中，检测固定的DNA探针的微阵列与互补靶分子的杂交程度。最近在蛋白质微阵列领域中的发展展示了它在酶-底物、DNA-蛋白质和不同类型蛋白质-蛋白质间相互作用中的应用。

在本文，我们讨论任何微小捕获-分子-配体 分析系统理论上的优缺点，并讨论蛋白质微阵列的应用将改变诊断方法和基因组和蛋白组的研究。

微小平行的微点配体结合分析的基本原理十年前就描述过。在“周围分析理论”中，Roger Ekins 及其同事 [14]解释了为什么微点分析比其他配体结合分析会更灵敏。那时，采用微小化的免役学分析系统已证明微点技术的高灵敏度和巨大的应用前景。

但是，由微阵列引起的巨大兴趣来自DNA芯片的工作。在一个有海量平行方式的反应中测定几千个不同的结合反应的可能性完美地符合生物学中基因组方法的需要。

全基因组测序方面的快速进展[5,6]和表达研究的渐增重要性[表达序列标签测序]与有效的合成为配体结合分析特异的捕获分子的体外技术正好匹配。寡核苷的合成和PCR的放大允许有效产生成千的高特异捕获分子。

主要是微技术和微流术的新进展建立了检测系统，并且计算机技术与生物信息学的进展与微阵列分析系统快速整合。现在，其中一些是在每平方厘米的面积内放入几千个不同的寡核苷探针的DNA微阵列，是能在单个实验中能产生大量的成对基因组数据的建立良好的高通量杂交系统。

但是，从基因表达的研究中知道mRNA水平与蛋白质表达并不一定相关[79]。蛋白质功能常常依赖于前提蛋白的翻译后处理，并且细胞通路的调节通常依赖蛋白质间的相互作用和/或诸如磷酸化的反向共价修饰而发生。

一个细胞的蛋白组的分析（即所有蛋白的量化、它们翻译后修饰的检测和这些如何依赖于细胞状态和环境的影响）没有新实验方法是不可能完成的。高通量蛋白分析方法需要一个快速、直接和定量的检测方法。因此，需要努力扩大除DNA芯片的微阵列技术的应用并建立微阵列方法来描述蛋白组[1012]。

微小配体结合分析：理论上的考虑

周围分析理论表明微小配体结合分析能够获得超高灵敏度。一个采用少量捕获分子和少量样品的系统可能比一个采用100倍多的材料系统更灵敏。Ekins及其同事发明了一种基于微阵列的灵敏分析技术，并且证明其具有高灵敏性。

有了这个系统，诸如甲状腺刺激素(TSH)或乙肝表面抗原(HbsAG)的分析可以定量至毫微微摩尔浓度的范围（相当于每ml含106个分子）。微小化是理解微小结合分析的关键。捕获分子固定在很小面积的固相载体上，微点―尽管捕获分子在系统中的数量小，但在微点中能获得高浓度的分子。

在分析中，靶分子即分析物被微点捕获，但是由于微点的小面积捕获分子-靶分子复合物的数目低。结果是即使靶分子的浓度低而结合反应具有高亲和力，但捕获过程并不显著改变样品中靶分子的浓度。

如果<0.1/K的捕获分子被固定（K代表结合反应的亲和常数），这就是事实。这些所谓的周围分析物分析条件允许这样的分析：从溶液中捕获的靶分子或分析物的数量直接反应它在分析系统中的浓度。

有趣的是：在周围分析物条件下浓度的测量使得系统独立于样品的真实体积，而给出的结果却兼容了高灵敏度与低样品消耗。高灵敏度的获得有两个原因。第一，结合反应发生在最可能高的靶浓度。第二，捕获-分子-靶复合物只在微点的小面积上，从而导致局部的强信号。

捕获分子以固定浓度固定在不断增加体积的点上。随着点的体积增加，在分析中的捕获分子的总数增加，从小点获得的总信号也增加。但是，信号浓度开始随着小点体积增加而减小，因为靶数量开始成为一个制约因素。捕获过程导致溶液中靶浓度的显著降低，而同时探针-靶复合物分散在一个较大范围。

结果从小点的任何一点获得的最大信号降低。减小微点的大小将降低每个微点的整体信号，但是对更小的微点信号浓度将增加。当微点大小小于某个值时，信号浓度将最优（周围分析物条件，靶分子的数量没有制约），并且将随着微点大小的变小而大约恒定。因此，在微点上能获得最高的信号强度核最优的信噪比。

微阵列技术

对DNA微阵列来说，预先合成的寡核苷酸或PCR-片段固定在固相支持物上，或在固相支持物直接合成寡核苷酸。从细胞中提取的靶分子，标记后与固定的互补捕获探针杂交，然后测量和定量被捕获的靶分子。

DNA芯片技术利用大量的靶分子能在大量的平行测量中测定而样品消耗低的事实。另外，用单个阵列可能完成两个不同样品的比较分析。在两个样品中的靶分子用两种不同的荧光素标记，相同数量的样品混在一起并与同一块微阵列杂交。在每个微点上的两个不同标记分子的比直接反应靶分子的浓度是相同或不同。

直接从DNA芯片技术转变过来，Haab等对抗体-抗原微阵列采用相同的双颜色标记程序。他们采用一套110对抗原-抗体来制造免疫分析微阵列，以此作为不同蛋白分析概念的证明。固定抗体或抗原，而相应的靶分子在诸如血清的复杂溶液中用荧光标记

。一个头上有抗原的样品标记成一种荧光，而包含不同浓度的抗原的另一个样品用另一种荧光标记。两种样品混合后，与同一块微阵列同时孵育。双颜色检测系统立即揭示被捕获靶分子的不同浓度。依赖抗体的亲和性，能够检测皮摩尔浓度的抗原。

但是，蛋白质通常以复合物存在，结果一个微点的强信号可能来自大量的靶分子或捕获一个大复合物。通常，他们的结果证明理论上可比较的分析方法能够从DNA转换到蛋白质。当从DNA转换到蛋白质后，必须知道DNA和蛋白质是有不同理化特性的不同种类分子。

DNA是由四种不同的核苷构成的单个分子，结构清楚，具有亲水性、带负电的糖骨架。相反，由20种不同的氨基酸组成的蛋白质产生不同特性的多样分子。蛋白质有亲水性的、不亲水性的；有酸性的和碱性的；还有翻译后修饰的（糖基化，乙酰化或磷酸化）。另外，蛋白质具有多样的个体分子结构。此外，当固定在微阵列中时，捕获蛋白质必须保持功能状态。

抗体是用来确定靶分子的最重要捕获分子。但是，由于生产单抗的繁重劳动，发展其他可替代物已成为十分必要。该领域最有希望的方法是与高多样性结合的噬菌体展示技术，完全合成产生人工抗体的文库。另一个策略是生产高特异性的寡核苷或aptamers多肽。

这些分子的生产和选择（如SELEX）应服从自动化和高通量捕获分子的产生。MRNA显示方法允许超多样性的文库的快速和有效生产，导致结合分子能结合几乎所有nMpM亲和力的靶分子。正在发展的蛋白质微阵列领域需要发展生产重组蛋白的高通量生产方法。

这些方法对成千的特异捕获分子的不断需求是个先决条件。只有这个困难得到解决，才能进行高浓度的蛋白质微阵列分析，而蛋白质微阵列分析是基于阵列的蛋白组学方法的主要工具。正在采取巨大努力来使重组蛋白的表达和纯化自动化。

已经在大肠杆菌和杆状病毒系统中发展了生产大量平行重组蛋白的微小表达系统。已经生产了高密度融合蛋白的微阵列来筛选抗体特异性，也已经生产了高密度单链抗体文库分析来确定适当的抗原。

Table 1.Classes of capture molecules

Capture molecules Source Technique Refs
mAb Mouse Hybridoma Reviewed in
[42,43]
scFv/Fab diabodies Antibody libraries Phage display, in vitro [1619,
evolution 4447]
Affinity binding agents Recombinant In vitro evolution [48]
fibronectin
structures
Affibodies Microorganism Heterologous expression [49,50]
Aptamers Library SELEX/mRNA display, [23,24,5154]
(DNA/RNA/peptide) in vitro evolution
Receptor ligands Synthetic Combinatorial chemistry [36,55]
Substrates of enzymes Synthetic; pro- and Protein purification, [33,34,37]
eukaryotic recombinant protein
organisms technology (bacterial
fusion proteins,
baculovirus, peptide
synthesis)
Abbreviations: Fab, antigen-binding fragment; sc Fv, single-chain variable region fragment; mAb,monoclonal antibody.The table summarizes classes of molecules that have the potential to be used or are actually used as capture molecules in protein microarray systems. The sources they are from and the key technologies used to generate such capture molecules are listed together with selected relevant references.

重组蛋白除了用于合适捕获分子的产生和分离外，它还用于制造允许快速有效的筛选高亲和性的与其他蛋白有最小或没有交叉反应的结合物的微阵列。捕获分子的选择性在所有基于微阵列的蛋白组学方法中是特别重要。

同时，为产生或完成DNA微阵列实验的产品已经能够商品化。市场上能提供DNA微阵列产品的公司已经超过100家

捕获靶的检测是通过电荷耦连设备（CCD）照相机或共焦检测仪的激光扫描头来完成的。另外，放射性、化学发光或无标记胞质共振检测系统也可采用。表面加强激光解吸附和电离（SELDI）技术采用质谱仪作为输出系统来分析微点阵列上的不同蛋白表达。

不同来源的细胞提取物在相同的化学吸附表面（例如阳离子-阴离子交换材料，憎水性表面）的不同点孵育。未结合蛋白被洗掉以后，所有非特异性捕获的靶蛋白能够在SELDI质谱仪下分析。质谱展示捕获蛋白的不同分子量。

来自两个不同样品的两套质谱数据立即鉴定出不同表达的蛋白。在某些情况下，不同显示的蛋白能通过分子量立即鉴定。但通常这些蛋白必须通过亲和层析富集，并且用已知的蛋白分析方法（如Edman测序、western杂交和digest mass fingerprinting）。

蛋白质微阵列

从理论上讲，任何形式的依赖于固定捕获分子和存在于周围溶液的靶（结合物或分析物）的产物形成的配体-结合分析能够微小化、平行化，并且在微阵列中完成。采用核酸-核酸相互作用（DNA芯片）的微阵列分析已良好建立，而蛋白微阵列分析刚开始普及。

这个体现在最近关于核酸-蛋白，蛋白-蛋白，配体-受体和酶-底物的微阵列分析的文章中。

以微阵列形式研究DNA-蛋白的相互作用是Bulyk等人完成的，他们创造了双链寡核苷的微阵列。单链寡核苷的高浓度微阵列是采用Affymetrix(Santa Clara, CA, USA)技术生产的。单链寡核苷微阵列通过酶延伸反应转变成双链寡核苷微阵列。

这些分析与对不同DNA序列的特异限制性内切酶孵育。在与限制性内切酶孵育以前被酶甲基化的双链DNA就没有DNA的切割。一般而言，DNA-蛋白相互作用分析对DNA结合的蛋白如转录因子的定性和鉴定是有用的。

用于酶-底物分析的酶有不同种类，如限制性内切酶、过氧化物酶、磷酸化酶和蛋白激酶。在概念性证明实验中，MacBeath and Schreiber将三种不同的激酶底物（每种底物对应一种特定激酶）固定在一块平板玻璃表面。相同的微阵列一个对应一种激酶与放射性标记的ATP孵育。

每种底物只被其特定的激酶磷酸化。在更高级的实验中，Zhu等人分析了来自Saccharomyces cerevisiae的119种不同蛋白激酶对17种不同底物的活性。他们采用带小孔的平板，其中底物共价结合在单个小孔中。

表达为谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合蛋白的激酶在小孔中与底物和放射性标记的ATP一起孵育。当激酶反应结束后，激酶与ATP被洗掉，而阵列用磷酸成像仪分析磷酸化底物。采用这种方法，鉴定单个激酶的新活性。能够磷酸化酪氨酸残基的酶的序列比较显示在他们的催化区域具有相同的氨基酸残基。

对受体-配体分析来说，由组合的固相化学产生的小有机分子固定在微阵列中。从组合合成而来的单个树脂珠放在96孔板中，而有机分子从珠中化学释放出来。有机分子被稀释、分散成小点，并且共价吸附在玻片上。

这些由所谓的小分子印刷术产生的微阵列与荧光标记的靶蛋白孵育来确定新配体。这种技术使得在极低样品消耗的情况下高通量的配体-受体相互作用筛选成为可能，这能够改善制药工业中活性底物的筛选。

在蛋白-蛋白相互作用分析的领域中，打点分析用于筛选固定蛋白与其他蛋白的特异相互作用。已经检测出在放射性标记的人p52 GST融合蛋白和诸如核蛋白或从HeLa细胞中分离的丝氨酸-精氨酸蛋白片段的固定捕获蛋白之间的特定相互作用。

另外，也展示了DNA、RNA或低分子量的配体与固定分子的相互作用。这些阵列可以进一步微小化，因此有可能以微阵列的形式完成。

Zhu等人的最近工作证明对蛋白组学分析的阵列方法的非常能力。作者从S. cerevisiae中纯化5800不同种重组蛋白后，生产了包含该微生物90%基因的基因产物的复杂蛋白芯片。这些微阵列能用于研究全基因组范围内的蛋白-蛋白相互作用。

利用钙调蛋白作模型蛋白来探查阵列，能够确证许多已知相互作用和测定一系列新的结合蛋白。这些蛋白的序列分析揭示存在一个结合基序，从而说明被发现的结合相互作用的重要性。用于检测蛋白-脂质相互作用的实验令人信服地说明鉴定能与低分子量复合物结合的蛋白是可能的。这就证实了直接从蛋白-药物相互作用检测整个蛋白组的可能性。

微阵列免疫分析对所有在一个样品中平行分析几个参数的诊断应用令人感兴趣。我们采用微阵列技术来筛选抗原-抗体相互作用。诸如系统风湿等自身免疫疾病的常用诊断标志的18种不同抗原固定在微阵列中，允许平行测定不同类型的抗体。

从1ml病人血清中可以高精确度地测定抗体滴度。夹心免疫分析也微小化、平行化并且可在微阵列中完成。这已被最近对生物样品中不同细胞因子水平的高特异性和灵敏性的平行测定所证明。用阳性、阴性对照和/或内参照的蛋白微阵列可精确定量。这最终将导致坚固稳定的诊断分析的出现。

结论

上述例子表明蛋白微阵列技术已经是研究不同种蛋白相互作用的有用工具。阵列生产和分析完成的进一步发展和优化，与蛋白靶和配体的高通量产生结合后，将戏剧性地扩大蛋白微阵列应用的数目。蛋白组学研究和诊断应用将是蛋白微阵列技术的两个主要应用领域。

在医学研究中，蛋白微阵列通过平行分析所有感兴趣的相关诊断参数将显著加速免疫诊断。样品体积的减少对那些只能获得微量样品的应用来说非常重要。一个例子是从微量活检样品中分析多个肿瘤标志。

此外，在疾病治疗中对病人的监测将发展这种新出现的技术。除DNA芯片的微阵列技术将加速蛋白-蛋白相互作用领域的基础研究，也将描绘从蛋白的有限数量到高浓度的蛋白组学阵列分析的蓝图。蛋白和肽阵列将用于分析酶-底物特异性，也用于测定高度平行模式的不同底物的酶活性。

蛋白微阵列技术的整个领域展示了由不断增加的基因组信息驱动的动态发展过程。诸如自动蛋白表达和纯化系统的新技术用于捕获蛋白的生产，分析全“蛋白组”的需要将驱动蛋白微阵列技术领域的快速发展。而故事才刚刚开始！