DNA微阵列技术介绍及其应用

DNA微阵列技术（microarray）指在固体表面（玻璃片或尼龙膜）上固定成千上万DNA克隆片段，人工合成的寡核苷酸片段，用荧光或其他标记的mRNA,cDNA或基因组DNA探针进行杂交，从而同时快速检测多个基因表达状况或发现新基因，快速检测DNA序列突变，绘制SNP遗传连锁图，进行DNA序列分析等的一种新技术，其基本原理是基于Southern杂交或斑点杂交技术。将DNA 微阵列称为基因芯片实际上是不确切的。 生物芯片 (bioship) 属于分子生物电子学范畴，只采用DNA或蛋白质等生物高分子为骨架制成大规模集成电路，用于研制第六代智能计算机。

DNA 微阵列有两种基本形式，即点样型DNA 微阵列和原位合成型DNA 微阵列。

点样型DNA 微阵列，通过PCR扩增的上万个DNA克隆，或常规合成的寡合苷酸被点样固定在一定固体表面（玻璃片，尼龙膜），用一组标记探针单独或混合处理检测。

制备方法：采用常规技术制备DNA，用点样仪自动点样在玻璃片上。

1.制备DNA片段：采用特异引物从各个克隆进行PCR扩增或将基因组DNA克隆到通用载体，然后纯化后重悬浮于undefinedSSC，使终浓度为0.5μg/μl.

2.微阵列制作：玻璃片清洗，包被多聚赖氨酸（35ml 多聚赖氨酸，35ml PBS,280ml ddH2O)，双蒸水冲洗，干燥。用微阵列仪点样，每种样品放5nl，用介层连接确定其互补序列。

制备方法：可改装一台半导体光印刷仪，采用光导向结合化学原理合成各种寡核苷酸探针。

1.玻璃片清洗后包被一层多聚赖氨酸。

2.在玻璃片上每个一定间距连接上带有光不稳定保护基的羟基。

3.UV照射，通过光印刷仪的遮盖膜使UV只穿过特定微孔射向玻璃片，将孔下的光不稳定保护基除去，产生自由羟基。

4.加入5’端带光不稳定保护基的磷酰胺碱基与自由羟基连接。

5.使遮盖膜微孔对准邻侧另一光不稳定保护基，重复4.5.依次有序进行，第一层碱基连接完毕后再进行第二层第三层.......。核苷酸探针的排列组成必须严格有序。

靶DNA与微阵列杂交及荧光标记检测：在检测靶基因不同表达水平时，常用一组不同荧光标记的mRNA和cDNA探针进行杂交。探针与微阵列在65度杂交16小时，依次用0.undefinedSSC,0.01%SDS,0.00undefinedSSC在室温下洗5min,除去未结合探针。然后用连接电脑的倒置扫描共聚焦显微镜阅读微阵列，扫描和资料分析。一般采用分析红色和绿色荧光杂交强度和比例的软件分析。

DNA微阵列技术的应用

一，检测基因表达水平及识别基因序列。Schena等1996年用拟南芥光调基因微阵列，以不同器官中的mRNA为探针，检测其基因表达水平，结果表明叶mRNA的表达水平是根的500倍。Shelon等1996年将酿酒酵母基因组DNA克隆制成微阵列，用6条最大染色体和10条最小染色体DNA探针分别标记上红，绿荧光标记进行杂交检测，结果表明95%的克隆在染色体上的定位与文献报道一致。Milosaljevic等1996年将大肠杆菌基因组DNA的15328个克隆制成微阵列，用997众寡核苷酸探针进行杂交检测，汇总结果通过计算机与E.coli序列资料库相比较，用此技术一次可识别4.6MbDNA序列结构。

二，检测表达状况，发现新基因。Wodicka1997年将覆盖酵母基因组全部ORF的26万种25mer探针，阵列于4张玻片，每张6.5万个探针，将酵母分加富和低限两组培养，研究不同生长条件下基因表达水平，结果表明90%的基因在两种条件下均表达，36种mRNA更多地在加富培养下表达，140种mRNA在低限培养中表达。此外，还发现了一批未见报道的新基因。

三，检测突变和多态性进行遗传作图。Hacia等1996年用96600寡核苷酸阵列，检测人癌基因BRCA1突变情况，将15个患者样品和对照样品分别用两种荧光标记，发现14人的该基因发生了一个剪辑突变，共出现8种多态性，突变表现在该基因外显子2的第22个密码子内。利用SNP制作人类遗传图谱，将是第三代遗传图谱，此技术完全以DNA微阵列为基础。

四，DNA序列分析。Donnel等1992，Pease等1994，Yershow等1996，Wallraff等1997都报道了采用DNA微阵列技术进行DNA序列分析。多数研究者采用先合成寡核苷酸序列制作微阵列，然后与标记的未知DNA序列杂交，通过荧光共聚焦显微镜扫描，计算机软件分析得出数据，也有研究者将被测DNA片断阵列，以标记的寡合苷酸为探针杂交测序。