微阵列 CGH 实验

一、cDNA阵列CGH

（1）阵列制备

与变性探针杂交前，先用封闭液（盖上盖片）在37℃封闭cDNA阵列1h

（2）随机引物标记基因组DNA

1.肿瘤和正常组织基因组DNA各2μg分别用Dnp II消化1〜1.5h。将消化产物进行纯化（QiaquickPCR试剂盒）、真空干燥，用25μL水重悬。

2.使用Bioprime标记试剂盒基本按说明书进行随机引物标记，稍作改动。100℃变性DNA和20斗随机引物（试剂盒中含有）5min，迅速放于冰上冷却，并加人2.5μL dNTP、1.25μL dCTP、IμL Cy3/Cy5-dCTP、IμL Klenow片段(试剂盒中含有），37℃孵育90min。

3.混合Cy3和Cy5标记产物，上样到Micrcon30滤器。2000g离心10min，检查样品容器确定标记产物的存在（紫色）。直接加入30μL Cot-1DNA、100μg酵母tRNA、20μg poly(dA-dT)，5000g离心20min。为了重新收集样品，加入15ml杂交缓冲液，将Micrcon30滤器倒置放入新的收集管，16000g离心1min。

（3）探针变性和杂交

1.在加热的水浴锅或PCR仪上100℃变性探针90s，冰上冷却探针后，在37℃复性0.5〜1h。

2.将探针加到微阵列上，盖上玻璃盖片并用橡皮泥封片。在65℃用杂交缓冲液湿润的湿盒中杂交16〜20h。

（4）洗脱

1.将cDNA微阵列于2×SSC、0.03%SDS中65℃洗5min，接着用1×SSC、0.2×SSC室温下各洗脱5min。

2.低速（50g)离心5min使标本片干燥。

二、阵列CGH

（1）阵列制备

1.基因组克隆（BAC、PAC、黏粒等）在相应抗生素存在的条件下生长，并用商业化试剂盒大量提取基因组DNA,—般得到10μg数量级的产物。用酚/氯仿的标准化程序进一步纯化DNA。

2.DNA大小和质量在1%琼脂糖凝胶电泳上评估，用UV光度计定量DNA。

3.靶DNA经超声波破碎得到1.5〜15kb片段，沉淀、重悬至适宜浓度，用毛细管以200〜400μm直径点样到玻璃载片上。

4.向阵列上加上20μL封闭液，盖上盖片，37℃湿盒复性1h。

（2）用缺口平移法标记基因组DNA制备探针

1.肿瘤和正常组织基因组DNA各2μg分别用缺口平移法进行标记，反应混合物如下：

A) Cy3反应物（加水至总体积100μL

(1)肿瘤基因组DNA:2μg。

(2)10×Cy3dNTP:10μL。

(3)DNA聚合酶1μL。

(4)DNaseI。

B) Cy5反应物（加水至总体积100uL):

(1)正常人基因组DNA:2μg。

(2)10×Cy5dNTP：10μL。

(3)DNA聚合酶1μL。

(4)DNaseI。

2.16℃标记反应1.5h后，将标记反应混合物放于冰上。

3.标记产物的大小在1%琼脂糖凝胶电泳进行评估，进行CGH实验的理想片段长度在500〜2000bp范围内。如片段过长，在反应混合物中加入适量的DNA聚合酶I和DNaseI，在16℃继续反应。

4.向标记反应混合物中加入0.1倍体积的0.3mol/LEDTA终止反应。

5.用Sephade×G50离心柱除去标记混合物中未掺入的核苷酸。

6.混合两种标记探针，加人50μL Cot-1DNA、0.1倍体积的3mol/L乙酸钠、2倍体积的冰冷100%乙醇沉淀探针。用70%乙醇洗涤沉淀、晾干，然后用20uL杂交缓冲液重悬探针。

（3）探针变性和杂交

1.75℃变性探针5min，然后在37℃复性0.5〜1h以充分封闭重复片段。

2.将探针加到完成预复性的阵列上，盖上盖片并橡皮泥封片，在37℃用杂交缓冲液湿润的湿盒中杂交24h。

（4）洗脱

1.阵列在55℃50%甲酰胺/2×SSC，pH7.0中洗3次，每次10min，然后在含0.1%NP-40,pH8的0.1mol/L磷酸钠缓冲液中室温洗5〜10min。

2.去掉多余的液体，加DAPI/抗淬灭剂后盖上盖玻片。

2.在自动化和实用的批量提取方法出现之前，许多实验室采用大量提取试剂盒提取靶DNA制备微阵列CGH。这是一种费时费力的实验，靶DNA在多次的阵列点样后用完时，需要反复多次的提取DNA。如果有足够的纯化靶DNA(用大量或小量制备，至少应有几百个纳克模板DNA)，DOP-PCR可用来提供无限的靶DNA。

3.在整个杂交过程中，确保微阵列湿润是至关重要的。随时加入杂交缓冲液以确保杂交盒湿润，以免探针或封闭混合物蒸发。如果微阵列干了，结果将不可信。

4.这里所列的是对在大约（18X16)mm2范围内达到3500个样的cDNA微阵列的优化实验方案。当采用较大点样区域内的较高密度的微阵列时，DNA量和最后的杂交体积必须按比例提高。

5.为得到高质量的微阵列CGH结果，未标记的基因组DNA片段大小和纯度是非常重要的。用于标记的DNA的纯度越低，得到的微阵列结果背景越高、杂交信号越弱。这里叙述的是从新鲜组织中提取基因组DNA进行微阵列CGH的最优实验方案。

6.选择用限制性内切核酸酶进行消化对提高标记效率非常重要。值得注意的是，降低标记前DNA片段平均长度，将提高标记效率，而过度消化得到的探针片段太小而不能用于与cDNA靶杂交。在我们实验室中，使用EcoRI消化人类基因组DNA得到非常满意的稳定结果。

7.在开始建立实验方法时，进行一系列的杂交和洗脱温度梯度实验，以得到最佳杂交强度和特异性。发现37℃杂交和55℃洗脱可非常灵敏地检测高拷贝获得和扩增，而洗脱温度提高到65℃将降低微阵列的信号强度。过低的洗脱温度可能产生非特异结合（过多的黄色信号）。我们建议预实验中用来源不同的样本DNA进行不同的标记，以得到最佳的实验技术特异性。

8.到目前为止，仍没有标准化的阵列制备方法。发表的论文中靶DNA浓度为400〜10μg/mL时，用人工点样在多聚赖氨酸处理的玻片上，或Zyg/yL靶DNA点样在氨丙基三甲氧硅烷处理过的玻片上[12]。请注意随着机器点样仪的自动化程序的出现，DNA浓度和玻片处理方法都可能随之改变。

9.这里提到的方法是假定在（22X20)mm²玻璃盖片范围内构建最大量的小格化点样面积。另外，假定靶DNA在阵列制备的过程中已经变性。否则，在与探针杂交前，微阵列必须在70%甲酰胺/4×SSC中变性2min

10.探针的最终长度依赖于DNA酶I的浓度。用于CGH实验的探针最佳长度在500〜2000bp范围内。酶的储存液浓度为1×10-4U/μL,实验前用DNA酶I稀释液新鲜配制成终浓度5×10-5U/μL的使用液。然而，随着要求所获得的DNA理想片段长度的改变，酶浓度也相应的做出调整。

11.将0.05〜0.1倍体积的每种标记混合物进行DNA染色（如溴化乙锭）的凝胶电泳。由于可以有助于阵列CGH的问题解决，所以推荐采用琼脂糖凝胶电泳评估标记