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    方案1 用 FLAG抗原表位标记蛋白质进行蛋白质免疫共沉淀

    相关实验：蛋白质复合体性质的研究

    最新修订时间：

    材料与仪器

    抗 FLAGM2 单克隆抗体 293 T 细胞
    抗 FLAGM2 琼脂糖亲和凝胶 甘氨酸 辣根过氧化物酶 IEF缓冲液 裂解缓冲液 NaCl 磷酸盐缓冲液 聚乙烯亚胺 RF10培养基 RPMI 1640 培养基 4 X SDS-PAGE 加样缓冲液 叠氮化钠 胰岛素
    大型离心机 配有检测 GFP 滤片的荧光显微镜 培养箱 微型离心机 微量离心管 针头 多预装层析柱 摇床 SDS-PAGE 和 2D-IPG SDS-PAGE 仪器 超滤柱

    步骤


    一、用于小范围分析的代谢标记

    在蛋白质相互作用的初步分析中，可以用代谢标记检测免疫共沉淀的蛋白质。 ⑨ 转染一天后，除去培养基，加 3m l新 鲜 的 含 有 [35S ] M et [终浓度为1.85X 106Bq/m l.(0. 05mCi/m l) ] 的 RFlO 培养基。 ⑩ 重新放置到培养箱中，培 养 16h。用这么长的标记时间，是考虑到了转换率 不局的蛋白质的标记。 可选择••虽然一些细胞在没有未标记的M et的 R FlO 培养基中时间太长会生长不 良，但在这种情况下可获得更高水平的结合。

    二、细胞裂解

    转 染 48h 后 ，用 IOml P B S 冲洗细胞两次。 警告：要确定已适当地除去了放射性废物。 ⑫ 弃 掉 所 有 的 PBS，每 个 IO cm 平 板 加 Im l ( 或 3m l/15c m 板）冰冷的细胞裂解 缓 冲 液 （ 用时现加人蛋白酶抑制剂）。 ⑬ 用细胞刮刀，将细胞从培养板上刮下来，将细胞裂解液移到微量离心管中。 ⑭ 细胞裂解液置于4°C 摇 床 中 lh ，进一步裂解。 ⑮ 4°C 、 1 3 0 0 ( ^ 离 心 IO m in， 除 去 核 和 细 胞 碎 片 ， 取 上 清 置 冰 上 。

    三、用于小范围分析的免疫共沉淀

    把 连 接 有 F L A G 抗 体 的 琼 脂 糖 珠 ，放 人 微 量 离 心 管 中 （2 5 4 / 免 疫 共 沉 淀 ）， 13000g 离 心 10s ，沉 淀 琼 脂 糖 珠 。 ⑫ 弃 掉 上 清 ，用细胞裂解缓冲液洗2 次 。每次冲洗后离心i〇s。 ⑱ 用 1 0 倍体积的裂解缓冲液，重悬浮琼脂糖珠，取 250jli1 (= 25jul琼脂糖珠） 到微量离心管中，短暂离心沉淀，除去多余的缓冲液。 ⑲ 加 I m l 预冷的细胞裂解液（ 得自第⑮ 步）到 F L A G 抗体-琼脂糖沉淀中。 4°C 下 ，将细胞裂解液与琼脂糖珠在摇床中孵育lh。 @ 13000^：离 心 10s， 沉淀琼脂糖珠。用 2 3 号针小心吸去上 清 。 ㉑ 用 I m l 新鲜的裂解缓冲液，洗涤琼脂糖珠5 次 。每次洗涤后，离心沉淀琼脂 糖珠，吸去上清。 @ 最后一次洗涤后，尽可能小心地吸去所有的上清。 ©用40沁10〇1!1111〇1/乙017化1^3)重悬琼脂糖珠，洗脱蛋白。离心沉淀琼脂糖 珠 ，把洗出物转移到一个新的微量离心管中。重复一次。 ⑭ 用 8yl l m o: l/L Tris (p H 8. 0 ) 中和最终的洗脱物（ 80jul)。 ⑮ 做 ID S D S -P A G E 分析时，加 4 X S D S 上样缓冲液到样品中，沸水 水 浴 5m i n。 做 2D 固 定 p H 梯 度 的 S D S -P A G E 分 析 ，用 I E F 缓 冲 液 将 样 品 稀 释 到 1 : 4 。 ID P A G E 和 2D P A G E 的细节分别见第2 章 和第4 章

    四、用抗体层析柱大规模富集 FLAG 标记的蛋白质以及与它相互作用的蛋白质

    在每个空的层析柱中加入0. 8m l 抗 F L A G 抗体-琼脂糖珠。 @ 用 I m l 的 O .lm d /L G ly 洗 涤 3 次 ，每次要等I m l 的液体完全通过柱后，再加 人下一次的洗涤液。 ⑳ 用 IOml P B S 洗涤柱子，并上下吹打琼脂糖珠，以加速这个过程。 ⑳ 用 2m l 裂解缓冲液洗涤柱子，让琼脂糖珠沉降，形成柱床。 ⑩ 将 50m l 预冷的细胞裂解液加人柱床，不要扰动柱床。这是个缓慢的过程，不 要 让 琼 脂 糖 珠的任何一处变干。留 20W 上 柱 前 的 细 胞 裂 解 液 ，用于后续的分析 (S 1)。 收集穿过柱子的裂解液，也 留 出 20沁 做 凝 胶 分 析 （ S2)。 在收集裂解液时，继 续用裂解缓冲液水化层析柱。 ㉛ 用 2 倍柱床体积的冰冷的裂解缓冲液，洗琼脂糖珠。上下吹打琼脂糖珠，以 加速进程，但要保证每次洗涤之间琼脂糖珠的沉降和流动。 ㉜ 用 2 倍柱床体积的冰冷的P B S 中和琼脂糖珠。 ⑬ 用 I m l O . lm o l/L Gly (p H 3 ) 洗 脱 蛋 白 质 6 次 ，每次加人洗涤液之间，让琼 脂糖珠流动。每个微量离心管收集I m l 的洗脱组分。 ⑭ 立 即 用 50/jd lm 〇 l/L T ris ( p H 8 ) 中和每个组分，每 次 留 出 作 分 析 （ S3〜 S8)。 © 用 2 倍 柱 床 体 积 的 〇. l m o l / L G ly (p H 3)， 洗 涤 琼 脂 糖 珠 ，上下吹打加速 进程。 ® 用 2 倍柱床体积的P B S 中和琼脂糖珠。
    接 加 叠 氮 化 钠 （ 终 浓 度 0 . 1 % ，体积比）到柱床里的P B S 中，封上柱子， 4°C 保存，供以后使用。 @ 将上述收集的20沁样品（ S I 〜S8)，用 抗 FLAG M 2 单克隆抗体和辣根过氧 化 物 酶 （ H R P ) 标记的抗鼠的二抗，做 Western blot分析。 层析柱从细胞裂解液中除去FLA G -蛋 白 X 的效率，可 通 过 在 S 2 中保留多少 FLA G -蛋 白 X 与起始物S l 中的比确定。 ⑯ 从洗脱组分 S 3〜S 8 中，合并 能 用 W estern b l o t检 测 到 的 FL A G -蛋 白 X 的 组分。

    五、用于纯化的蛋白质浓缩

    将含有FLA G -蛋 白 X 的组分合并，放入一个超滤离心管中，根据供应商提供 的说明书，进行浓缩。 实验提示：一个 C entricon-IO 的超滤离心管的截留分子量是10000， 如果免疫共 沉淀的蛋白质（ 即与蛋白X 相互作用的蛋白质）的分子质量超过I O k D a ,上述超滤 离心管就适用。其他 C en trico n离心管应用于更小的蛋白。 ⑪ 当全部的合并成分，浓缩到很小的体积时（ 如 50jul) , 倒置 C en trico n离心管， 根据供应商的说明书，浓缩回收物。 ⑫ 用 I E F 缓冲液1 : 4 稀释样品。 实验技巧：有些蛋白质可能会结合到Centricon离心管的超滤膜上，用 I E F 缓冲 液可以把它们洗下来。

    六、纯化和鉴定相互作用蛋白

    用 2 D IP G /S D S -P A G E 分离蛋白质（ 见第 4 章）。 ⑭ 用考马斯亮蓝染色，显示出与蛋白X 相互作用的蛋白质。 ⑮ 用纳米级电喷射离子化串联质谱鉴定这些蛋白质，方法参阅第8 章。 实例研究 D I A B L O 是一个能与哺乳动物细胞死亡抑制蛋白I A P 同源物A (M I H A ) 相互作用 的蛋白质。要 想 做 D I A B L O 的鉴定，首先用带有一个 C 端 F L A G 抗原表位标签 (F L A C^ M I H A )的 编 码 M I H A 的 c D N A 表达载体，瞬时转染 293 T 细胞，在最初分析 [ 35S] M e t 标记的细胞裂解液时，可以检测到与F L A O M I H A 特异性免疫共沉淀的符合 D I A B L O 的一个蛋白点，而不是别的与F L A G 标记蛋白无关的蛋白。要鉴定D I A B L 0, 从 100个 15c m 瞬时转染F L A G -M I H A 的293 T 细胞的培养皿中，制备细胞裂解液，通 过抗F L A G 抗体偶联的琼脂糖珠层析柱。充分洗涤后，用酸性的G l y 洗脱结合的蛋白， 采用 Amers h a m Biosciences Multiphor 系统，做双向 IPG/S D S - P A G E (见图 10.1 4 ) 分 离，第一向用11〇11(?113〜10)胶条分离，用预制的竖背式（3〇11(1七&〇1〇303 8%〜 18%梯度的聚丙烯酰胺做第二向分离。用 PhastG el考马斯亮蓝R 染 色 （ 除了在第一步 中，用固定液C 替代固定液N ，其余的按照《Multiphor电泳系统使用手册》中所讲的 考马斯亮蓝染色步骤），符 合 D I A B L O 的染色凝胶点切下做分析（ Verhagen， etal， 2 0 0 0 ) 。

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    来源：丁香实验

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