方案4 BN-PAGE 蛋白质分析法

一、梯度胶的制备

目前常用 4%~16.5% 的丙烯酰胺梯度胶和 4% 的丙烯酰胺浓缩胶，可以分离分子质量 1000kDa 到约 40kDa 的蛋白质复合体。但因为凝胶的顶端较易破碎，若分析的复合体蛋白分子质量小于 600kDa，可采用 6%~16.5%(或其他）的梯度胶。在制胶时，应准备好足够量的丙烯酰胺凝胶混合液，这可为重复性实验提供方便（见表 10.3)。高浓度的丙烯酰胺凝胶混合液，含 10%(体积分数）的甘油，这样可避免灌胶时造成层界混淆，有助于形成较好的梯度。将一个小磁棒放人装有高浓度的丙烯酰胺凝胶混合物的容器中，尔后再将其置于磁力搅拌器的中心位置上，便可组成一个简易的制胶器。容器里的溶液按一定的速度被搅拌，以便相互混合。但在某些情况下，高速度的搅拌会使低浓度胶较慢进入混合容器。要了解关于灌制梯度胶的其他信息，请参看图 10.17 和第 2 章方案 1 中的内容。

1.计算制胶所需的凝胶体积，除去梳子制备上样孔所占据的凝胶高度外，还需灌人约 2.5 cm 长的浓缩胶（对于大小为 18 cmX16 cm、厚度为 1mm 的胶板来说，每种浓度的丙烯酰胺混合液灌人 9 ml 的胶，即在梯度胶上方留出 5 cm 的空隙），向两个梯度凝胶槽灌入确定体积的各种浓度的丙烯酰胺混合液。

2.每 9 ml 的丙烯酰胺梯度胶混合液中，加入 4ul 的 TEMED 和 40ul 0.lg/ml 的过硫酸铵，充分混勻。

不同体积的凝胶液，需要加入不同体积的 TEMED 和过硫酸铵。

3.打开泵，开启两个梯度混合液容器之间的阀门，使低浓度的凝胶混合液能流入高浓度混合液的容器中并与之混合。

实验提示：流速必须相当快，持续不断的凝胶流动，有助于形成较好线性梯度的梯度凝胶。

4.在玻璃板间的凝胶液面上，加入异丙醇，以压平胶面并促进凝胶聚合。

5.用毕后，须立即彻底洗净制梯度胶容器，并用水冲洗，以免丙烯酰胺聚合后堵塞仪器。

6.凝胶聚合后，倒掉异丙醇。用蒸馏水冲洗胶面上端，并用滤纸吸干玻璃板内侧水渍。

7.制备 4% 的浓缩胶（见表 10.3)，并将其灌入已聚合好的梯度胶上端。

8.将梳子小心地插人浓缩胶内，从一头开始放人，以免在接触面产生气泡。

9.胶完全聚合好以后，随即 4°C 下保存。在保湿条件下（如用蘸有水的纱布包胶，再用塑料膜将其包裹起来），凝胶可稳定保存一周以上。

二、加样

10.拔掉梳子，用蒸馏水冲洗梳子孔，以除去未聚合的丙烯酰胺和残留的试剂。

11.用适当的溶解缓冲液，重悬蛋白质样品，最大速度 4°C 下离心 5 min，以沉淀所有聚集物。

12.在样品溶液中，加上样染料（大胶中每 45ul 样品中加入 5ul 染料，小胶则每 1 知 1 样品中加人 2ul 染料）。

13.用微量注射器（或上样吸头）将样品注人加样孔中。在每次加不同样品时，切记用水彻底将微量注射器洗净，加样完毕后，轻轻倒入阴极缓冲液 I。

备选方案：也可先倒入阴极缓冲液 I，再在缓冲液中加样，样品会沉入上样孔底部。

三、电泳条件

14.采用大胶时，先加 100V 电压，直至样品迁移到浓缩胶末端，再换用 500V 的电压使样品迁移过分离胶（整个电泳过程耗时约为 5 h)。

备选方案：给每块大胶设定 6mA 的恒流，在最大电压不超过 180V 的条件下，可电泳 16 h，若为小胶，则在 6mA 恒流，最大电压不超过 400V 条件下，电泳 80 min。

15.待考马斯亮蓝进人凝胶后，至少迁移到梯度胶顶部界面时，用阴极缓冲液 n 替换缓冲液 I。由于缓冲液 n 中不含考马斯亮蓝，因此在电泳过程中可观察到蛋白质在胶中的迁移情况，若要对蛋白质作电印迹分析，就必须转移到缓冲液 n 中。

备选方案：如果预先知道电泳所需要的时间，也不需要对蛋白质作电印迹分析，则可在电泳全程中只采用缓冲液 I，只要在电泳完后对凝胶进行脱色处理，便可以看到蛋白质复合体了。

16.待考马斯亮蓝迁移到凝胶底部时，便可停止电泳。对凝胶进行染色，使蛋白质显现出来（步骤17）。然后可将蛋白质转移到 PVDF 膜上，做电印迹分析（步骤19），或采用 SDS-PAGE 法分离蛋白质复合体的各蛋白组分（步骤21）。

四、蛋白质复合体染色

在电泳后一般可直接看到蛋白质复合体，如进一步染色，可观察到另外的一些复合体。

17.用染色液浸泡凝胶，在摇床上轻摇 lh。

18.不断更换脱色液，直至凝胶上显现出清晰的蛋白质条带。

五、蛋白质复合体电印迹法

19.将凝胶放入 IX 的 SDS-PAGE 电泳缓冲液中，浸泡 20 min。

20.转移缓冲液冲洗凝胶后，用半干转移法，将蛋白质电转移到 PVDF 膜上。大胶的转移条件设为 200mA 恒流、I.5 h。

实验提示：这里不能用 NC(硝酸纤维素）膜，因为考马斯亮蓝可同 NC 膜发生不可逆的结合，从而导致以后的一些步骤（如免疫修饰）出现问题。

六、SDS-PAGE 法分离蛋白质复合体的各蛋白组分

要分析蛋白质复合体的组分，可采用 SDS-PAGE 法进行第二向电泳。这种方法在对蛋白质进行免疫修饰分析时显得尤为重要。因为多克隆抗体经常会与样品中的其他蛋白发生交叉反应，所以会给 BN-PAGE 印迹修饰造成异常结果。为了确定免疫检测得到的复合体中确实含有目的抗原，可从 BN-PAGE 凝胶上切下一个孔的蛋白条带，使用 SDS-PAGE 可得到各个复合体上分离下来的蛋白组分（图 10.18)。

21.用剌须刀片或制薄胶用的垫片边缘，从 BN-PAGE 上切下一条蛋白胶条。

实验提示：在进行 SDS-PAGE 前，将凝胶条用封口膜包好后，放在一 80°C, 可长期保存。

22.用剃须刀片尽可能地将染料迁移所到达位置蓝色胶条底部切掉（含有染料和去污剂），使这一末端部分富集的大量考马斯亮蓝点，不会在进行 SDS-PAGE 时在凝胶中弥散。

23.将凝胶条在 0.02 g/ml 的 SDS(含 0.2mol/L 的 DTT) 溶液中浸泡 20 min。

24.吸去凝胶条上残留的溶液，用镊子将凝胶条轻轻地放置在其中的一块胶板上 (胶板用于灌制 SDS-PAGE 胶，第 2 章方案 1)，注意将凝胶条放置在上样孔通常所处的位置上。放上另一块胶板，使得凝胶条夹在两块板之间，形成「三明治」（图 10.18)，两板之间空隙的厚度与 BN-PAGE 用的相同。

25.将分离胶灌入胶板空隙中，至胶平面距胶条下沿 3 cm 处。用异丙醇覆盖胶平面。在制胶时，为避免弄湿胶条，应从其侧面倾斜灌胶。

26.胶聚合好后，倒掉异丙醇，灌入浓缩胶溶液，直至覆盖住 BN 胶条。注意不要在胶条下沿产生气泡。

27.作对照。将具有两个齿的梳子插人胶条边的浓缩胶中，一个上样孔加人 SDS-PAGE 分子量标准物，另一个上样孔加人作 BN-PAGE 的蛋白质抽提物，但在这里，先将蛋白质抽提物溶于 Laemmli 上样缓冲液中，煮沸变性（见第 2 章方案 1)。

28.在 SDS-PAGE 常规条件下电泳（见第 2 章方案 1)。

29.电泳完毕后染色，对蛋白质进行电印迹分析或处理单独的蛋白点，对其进行质谱分析。

用双向电泳法得到的各个点的蛋白质，可用多种方法对其进行测序分析，或直接从 BN-PAGE 胶上切下蛋白质复合体所在部分的胶块，经蛋白酶水解（如胰酶）消化后（Matsudana，1 卯 3; 参见第 7 章方案⑶，用 HPLC 法分离肽段，再用 Edman 降解法测序（见第 6 章方案 1) 或对其进行质谱分析（见第 8 章）。