蛋白质组实验全套流程方案
互联网
蛋白质数据库(Protein databank, PD)由美国自然科学基金会、能源部和国立卫生研究院共同投资建立，主要由X-射线晶体衍射和核磁共振(NMR)测得的生物大分子三维结构所组成，用户可直接查询、调用和观察库中所收录的任何大分子三维结构。该数据库同时提供蛋白质序列及其三维空间晶体学原子坐标．其中受体-配体、抗原-抗体、底物-酶复合物等相互作用分子的共结晶图谱是基于同源比较的分子设计所需的最佳模型，因此PDB数据库为初步的蛋白质合理设计提供了重要的知识来源。
由于PDB主要由生物大分子三维结构所组成，它具有以下几种功能：
( 1 )能够查找目的蛋白质的结构；
( 2 )可进行一级或高级结构的简单分析；
( 3 )与互联网上的其它一些数据库，如GDB、GenBank、SWISS-PROT、PIR等链接，从而可查询蛋白质的其它信息；
( 4 )可下载有关结构信息以供进一步使用.可通过关键词,PDB 标识符等进行查询.
在序列分析中，PDB主要可应用于蛋白质结构预测和结构同源性比较。其中NRL-3D数据库则是PDB数据库中所有蛋白质序列的信息。该数据库允许进行基于结构的序列比较，网址为：http://www.rcsb.org/pdb/ 。
聚丙烯酰胺凝胶的配制
表1 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液
|
溶液成分 |
不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml） |
|||||||
|
5 |
10 |
15 |
20 |
25 |
30 |
40 |
50 |
|
|
6% |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
水 |
2.6 |
5.3 |
7.9 |
10.6 |
13.2 |
15.9 |
21.2 |
26.5 |
|
30%丙烯酰胺溶液 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
8 |
10 |
|
1.5 mol/L Tris (pH8.8) |
1.3 |
2.5 |
3.8 |
5 |
6.3 |
7.5 |
10 |
12.5 |
|
10% SDS |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.25 |
0.3 |
0.4 |
0.5 |
|
10%过硫酸氨 |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.25 |
0.3 |
0.4 |
0.5 |
|
TEMED |
0.004 |
0.008 |
0.012 |
0.016 |
0.02 |
0.024 |
0.032 |
0.04 |
|
8% |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
水 |
2.3 |
4.6 |
6.9 |
9.3 |
11.5 |
13.9 |
18.5 |
23.2 |
|
30%丙烯酰胺溶液 |
1.3 |
2.7 |
4 |
5.3 |
6.7 |
8 |
10.7 |
13.3 |
|
1.5 mol/L Tris (pH8.8) |
1.3 |
2.5 |
3.8 |
5 |
6.3 |
7.5 |
10 |
12.5 |
|
10% SDS |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.25 |
0.3 |
0.4 |
0.5 |
|
10%过硫酸氨 |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.25 |
0.3 |
0.4 |
0.5 |
|
TEMED |
0.003 |
0.006 |
0.009 |
0.012 |
0.015 |
0.018 |
0.024 |
0.03 |
|
10% |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
水 |
1.9 |
4 |
5.9 |
7.9 |
9.9 |
11.9 |
15.9 |
19.8 |
|
30%丙烯酰胺溶液 |
1.7 |
3.3 |
5 |
6.7 |
8.3 |
10 |
13.3 |
16.7 |
|
1.5 mol/L Tris (pH8.8) |
1.3 |
2.5 |
3.8 |
5 |
6.3 |
7.5 |
10 |
12.5 |
|
10% SDS |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.25 |
0.3 |
0.4 |
0.5 |
|
10%过硫酸氨 |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.25 |
0.3 |
0.4 |
0.5 |
|
TEMED |
0.002 |
0.004 |
0.006 |
0.008 |
0.01 |
0.012 |
0.016 |
0.02 |
|
12% |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
水 |
1.6 |
3.3 |
4.9 |
6.6 |
8.2 |
9.9 |
13.2 |
16.5 |
|
30%丙烯酰胺溶液 |
2 |
4 |
6 |
8 |
10 |
12 |
16 |
20 |
|
1.5 mol/L Tris (pH8.8) |
1.3 |
2.5 |
3.8 |
5 |
6.3 |
7.5 |
10 |
12.5 |
|
10% SDS |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.25 |
0.3 |
0.4 |
0.5 |
|
10%过硫酸氨 |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.25 |
0.3 |
0.4 |
0.5 |
|
TEMED |
0.002 |
0.004 |
0.006 |
0.008 |
0.01 |
0.012 |
0.016 |
0.02 |
|
15% |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
水 |
1.1 |
2.3 |
3.4 |
4.6 |
5.7 |
6.9 |
9.2 |
11.5 |
|
30%丙烯酰胺溶液 |
2.5 |
5 |
7.5 |
10 |
12.5 |
15 |
20 |
25 |
|
1.5 mol/L Tris (pH8.8) |
1.3 |
2.5 |
3.8 |
5 |
6.3 |
7.5 |
10 |
12.5 |
|
10% SDS |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.25 |
0.3 |
0.4 |
0.5 |
|
10%过硫酸氨 |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.25 |
0.3 |
0.4 |
0.5 |
|
TEMED |
0.002 |
0.004 |
0.006 |
0.008 |
0.01 |
0.012 |
0.016 |
0.02 |
表2 配制6% Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所用溶液
|
溶液成分 |
不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml） |
|||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
8 |
10 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
水 |
0.68 |
1.4 |
2.1 |
2.7 |
3.4 |
4.1 |
5.5 |
6.8 |
|
30%丙烯酰胺溶液 |
0.17 |
0.33 |
0.5 |
0.67 |
0.83 |
1 |
1.3 |
1.7 |
|
1.5 mol/L Tris (pH8.8) |
0.13 |
0.25 |
0.38 |
0.5 |
0.63 |
0.75 |
0 |
1.25 |
|
10% SDS |
0.01 |
0.02 |
0.03 |
0.04 |
0.05 |
0.06 |
0.08 |
0.1 |
|
10%过硫酸氨 |
0.01 |
0.02 |
0.03 |
0.04 |
0.05 |
0.06 |
0.08 |
0.1 |
|
TEMED |
0.001 |
0.002 |
0.003 |
0.004 |
0.005 |
0.006 |
0.008 |
0.01 |
双向电泳常用溶液配方
A. 水化 / 上样缓冲液 (rehydration/sample lysis buffer)
水化上样缓冲液（I） 1ml
urea 8M 0.48g
CHAPS 4% 40mg
DTT 50~65mM 7~9.8mg
or TBP 2mM 10µl
40% Bio-Lyte 0.2%(w/v) 5µl
1%溴酚蓝 0.001% 1µl
MilliQ水 650µl
水化上样缓冲液（II） 1ml
urea 7M 0.42g
thiurea 2M 0.152g
CHAPS 4% 40mg
DTT 50~65mM 7~9.8mg
or TBP 2mM 10µl
40% Bio-Lyte 0.2%(w/v) 5µl
1%溴酚蓝 0.001% 1µl
MilliQ水 650µl
1. 水化上样缓冲液（I）中的尿素浓度可以调高到9或者9.8M；用7M Urea和2M Thoiurea溶解蛋白的能力较单用尿素强。
2. 目前常用的去垢剂为CHAPS，也可用Triton X-100、NP-40等代替。
3. 可以加蛋白质酶的抑制剂和/核酸酶。
4. 还原剂可用DTT或TBP，分离碱性蛋白时最好用TBP。
5. 5溴酚蓝作为指示剂，可以监测上样和聚焦过程，如操作熟练，可以不加。.
B ．溴酚蓝储液
Final concentration Amount
Bromophenol blue 1% 10mg
Tris-base 50mM 6mg
MilliQ H2 O to 1ml
C. 胶条平衡液贮存液 （SDS equlibration buffer）
(50mM Tris-cl pH8.8, 6M Urea, 30% glycerol, 2% SDS, bromophenol blue, 200ml)
|
|
Final concentration |
Amount |
|
1.5M Tris-cl,pH8.8 Urea (Fw 60.06) Glycerol(87% v/v) SDS(Fw 288.38) 1%Bromophenol blue solution
|
50mM 6M 30%(v/v) 2%(w/v) 0.002%(w/v) |
6.7ml 72.07g 69ml 4.0g 400μl To 200ml |
分装后贮存于-20℃；溴酚蓝可以不加；
用之前在加DTT(20mg/ml)或者碘乙酰胺(25mg/ml)。
D. 10% (v/v)SDS 溶液
SDS(Fw 288.38) 10.0g
MilliQ H2 O To 100 ml
用0.45微米的滤纸过滤室温保存(高纯试剂一般不用过滤)
E. 聚丙烯酰胺单体贮存液 （Monomer stock solution）
|
|
Final concentration |
Amount |
|
Acrylamide |
30% |
150g |
|
N,N’-methylenebisacrylamide or PDA |
0.8% |
4.0g 5.0g |
|
MilliQ H2 O |
|
To 500ml |
用0.45微米的滤纸过滤(可不过滤), 4℃避光保存
F. 4x 分离胶溶液 (4x Resolving gel buffer, 1.5M Tris-Cl pH8.8)
|
|
Final concentration |
Amount |
|
Tris-base(Fw 121.1) MilliQ H2 O HCl(Fw 36.46) |
1.5M |
181.5g 750ml Adjust to pH8.8 |
|
MilliQ H2 O |
|
To 1000ml |
用0.45微米的滤纸过滤，4℃保存
G. 10% 过硫酸铵
</, , , TR>|
|
Final concentration |
Amount |
|
Ammonium persulphate(APS) MilliQ H2 O |
10% |
1g To 10ml |
当加入水时，新鲜的过硫酸铵会发出“咔嚓”声音。如果没有声音，则需要换新的药品。可少量(10ml)配制，分装后4℃保存。
H. 电泳缓冲液 （TGS electophoresis buffer）
(25mM Tris,192 mM glycine, 0.1%SDS)
|
|
Final concentration |
Amount |
|
Tris base Glycine SDS MilliQ H2 O |
25 mM 192mM 0.1%(w/v) |
15.1g 7.55g 72.1g 36.05g 5.0g 2.5g To 5000ml To 2500ml |
该溶液的pH值不需调整，可直接在大试剂瓶中配制溶液，室温保存。
J. 琼脂糖封胶液 （Agrose sealing solution）
|
|
Final concentration |
Amount |
|
TGS electophoresis buffer Agrose (NA or M) 1% Bromophenol blue |
--- 0.5% 0.002%(w/v) |
50ml 0.25g 100μl |
