🔥 染色质免疫共沉淀实验（ChIP）

染色质免疫共沉淀-芯片/序列分析技术，是指染色质免疫共沉淀与 DNA 芯片以及二代测序结合的技术。

染色质免疫共沉淀-芯片/序列分析技术的基本原理是利用染色质免疫共沉淀获取 DNA 片段然后通过 DNA 芯片或者二代测序技术对 DNA 片段进行鉴定。

染色质免疫共沉淀-芯片/序列分析技术可用于分析转录因子的 DNA 结合位点，另一方面用于基因位点特异的组蛋白修饰模式研究。

器材：

离心机、超声仪、金属浴；

试剂：

（一）蛋白质-DNA复合物的化学交联

常用甲醛进行生物大分子复合物的化学交联。甲醛能够进入细胞，使蛋白质与 DNA 或蛋白质与蛋白质之间发生共价交联，稳定细胞内原本形成的复合物。

A. 室温下用 PBS 离心漂洗培养细胞 2 次，并重悬至约 5 x 10⁵ cells/ml (细胞总数约 2 x 10⁷)， 加入甲醛，至终浓度为 1% (每 4 ml 培养液中加入 37% 甲醛 67.5 µl)，室温下静置 10 min。

注：控制交联时间。

B. 加入终浓度 0.125 mol/L 的甘氨酸以终止交联反应。

C. 离心沉淀细胞，用冰 PBS 漂洗 1 次。

D. 用 6 ml 细胞裂解液重悬细胞。

E. 离心 2000 r/min，5 min 后收集核粗提取物沉淀。

F. 用 PBS 再次漂洗沉淀，沉淀可用于下一步操作或 -20 ℃ 冷冻储存。

（二）染色质的破碎

细胞内染色质中 DNA 的长度将影响免疫沉淀效果和 DNA 片段的获得，为此可以使用超声物理破碎或限制性内切核酸酶酶切消化，以获得所需长度的 DNA 片段。

A. 用 1.9 ml 高盐裂解液重悬浮沉淀，然后移入 2 ml 的微量离心管以备超声，采用预先选择的最佳条件超声处理。

注意事项：超声处理过程中，样品需要始终保持在冰浴中。

B. 4 ℃、10000 r/min 离心15 min，保留上清，进行蛋白质浓度测定。

注：提前预冷离心机。

C. 使用含 100-500 µg 蛋白质的超声破碎的核提取物，加入 50 µl 蛋白 A/G-琼脂糖珠，4 ℃ 下孵育 30 min 去除非特异性结合成分。4 ℃ 最大速度离心 5 min。

D. 在上清液中加入第一抗体，并在 4 ℃ 下孵育过夜。

E. 加入 50 µ1 A/G PLUS-Agarose 并置于 4 ℃ 孵育 2 h，12000 r/min 离心 20 s，收集球珠并置于冰上。

F. 用 1 ml 高盐细胞裂解液漂洗球珠 2 次，用漂洗缓冲液漂洗沉淀 4 次，用 400 µl 洗脱液重悬浮球珠。

G. 将试管置 67 ℃ 水浴 2 h 以打开交叉联接，期间混匀数次。离心后移去球珠，上清液继续置于 67 °C 过夜。10000 r/min 离心3 min 移去残余球珠，保留上清。

H. 用 500 µl 石炭酸／氯仿／异戊醇（25:24:1）提取含有 DNA 的上清液 1 次，充分混匀。14000 r/min 离心 3 min 使两相分离，保留水相，然后用 100 µl TE 提取有机相 1 次，并入水相。

I. 用 600 µl 石炭酸／氯仿／异戊醇再提取混合的水相。

J. 可用商品化的试剂盒浓缩 DNA。

注：高盐裂解液（1x PBS，1% NP-40，0.5% 脱氧胆酸钠， 0.1% SDS 和蛋白酶抑制剂 Cocktail），漂洗缓冲液（100 mm/L，pH8.0，500 mmol/L LiCl，1% NP-40 和 1% 脱氧胆酸），洗脱液（1% SDS，0.1 mol/L NaHCO₃）。

（三）免疫沉淀

抗体的特异性和亲和力对于是否获得足够纯度的靶蛋白及与之相结合的 DNA 片段至关重要。

抗体的非特异性结合导致最大的非目标靶点 DNA 片段随之沉淀，造成假阳性，从而掩盖了真实的蛋白质结合位点信息；而亲和力较差的抗体，则无法有效地沉淀 DNA 结合蛋白及其靶点 DNA 片段。

另一方面，在甲醛交联过程中，蛋白质构象会受到影响，可能会掩盖一些蛋白质的表位，影响到部分蛋白质和 DNA 复合体的免疫沉淀反应。

因此，一些适用于蛋白质印迹或免疫组化的抗体，并不能保证一定能够成功地进行 ChIP 实验，需要充分尝试可利用的抗体，以获得最佳效果。

（四）DNA 鉴定

在免疫沉淀复合物中的 DNA 分离提取后，可以通过 PCR 来进行鉴定。无论是 EMSA 实验还是 ChIP 分析，都可以较好地用于分析特定转录因子与相应 DNA 元件的结合活性，既可以用于定性分析，也可以进行相对定量分析，获得转录因子活化程度的相关信息。

现有的方法主要局限于已知蛋白质及其结合的 DNA 片段分析，进行 DNA 芯片或者二代测序鉴定。

1. 如果交联效果不好，可以先用其他化学交联剂，如二甲基已二亚酰胺化合物（dimethyl adipimidate, DMA）或双琥珀酰亚胺戊二酸酯（disuccnimidyl glutarate, DSG）等处理细胞，以加强后续甲醛交联的效果。

2. 破碎 DNA 是 ChIP 实验成功与否的重要因素，超声破碎效果与细胞类型、细胞浓度及裂解液成分等因素有关。超声处理后的提取物的液体应从浑浊状态变为透明状态。

实验前，应试用不同超声时间和强度，确定将 DNA 切割至大小约 200-500 bp 的最优条件。

3. 尽可能选取 ChIP 或 IP 级别特异性抗体。