染色质构象捕获技术

染色质构象捕获技术，是指研究染色质之间在细胞核内空间上的相互作用。

染色质构象捕获技术的基本原理是利用相互作用染色质在空间构象上存在物理接触的原理,可以鉴定某一特定染色体区域相互作用或长距离调控的区域或基因，图解示意如下图。

染色质构象捕获技术可用于研究染色质的结构属性和空间分布，以及认识和评估基因表达调控、DNA复制、重组和修复。

器材：

离心机、恒温摇床、PCR反应仪器。

试剂：

①甲醛、甘氨酸、蛋白酶抑制剂（1 mmol/L PMSF, 1 µg/ ml aprotinin 和1 µg /ml pepstatin A）、2 x 限制性内切核酸酶缓冲液;

②1 X T4 连接酶缓冲液（含 1% Triton X-100 )、蛋白酶K;

染色质构象捕获技术的基本过程可分为如下几步：

（一）化学交联

A.甲醛交联DNA和蛋白质：收集细胞约1X10⁷,加入37% 甲醛溶液至终浓度1% ，室温10~ 30 min。加入1 mol/L甘氨酸至终浓度0.125 mol/L终止交联反应。

注意事项：细胞数量、甲醛最终浓度以及交联时间。

B.分离完整的细胞核：用预冷的含蛋白酶抑制剂(1 mmol/L PMSF, 1 µg/ml aprotinin和1µg/ml pepstatin A)的PBS迅速洗细胞2次，收集细胞，每个样品加入1.5 ml含有蛋白酶抑制剂（同上）的细胞裂解液。冰上放置10~30 min, 4 ℃、4000 r/min离心5 min,弃上清，收集细胞核。

（二）RE 消化

将上述步骤得到的细胞核用0.5 ml 2x限制性内切核酸酶缓冲液重悬，同时加入适量的SDS至终浓度为0.2% ,在37 ℃摇床中温育(200 r/min)30 min。加入TritonX-100至终浓度为1% ,继续在37 ℃摇床中温育(200 r/min)30 rnin。加入400 U酶，在37 °C摇床中温育(200 r/min)过夜酶切。65 °C 20 min使酶失活。

（三）连接

A.将失活的酶切产物用1X T4连接酶缓冲液（含1% TritonX-100)稀释20倍，在37 ℃摇床中温育(200 r/min)30 rnin。加入30U连接酶，4 ℃过夜连接。

B.加入3 µl 10 mg/ml蛋白酶K, 65 ℃孵育过夜，去除交联蛋白质。

（四）PCR反应