🔥 细胞侵袭检测

恶性肿瘤向邻近的组织侵犯称为侵袭。检测肿瘤侵袭能力是判断肿瘤转移能力的一种方法。

Transwell 小室置于 24 孔的培养板中，分为上下室，上室底部为一层聚碳酸酯膜，这层膜具有通透性，将上室培养液和含下室培养液隔开，但是肿瘤细胞可以通过，下室中的培养液（如血清中的趋化因子）可以吸引上室中的细胞。

利用 transwell 侵袭实验可以检测肿瘤细胞的侵袭能力。

① 细胞样品（细胞状态好）

② 耗材：EP 管、24 孔板、8 μm 孔径的 Transwell 小室、冰盒。

③ 试剂：无血清培养基、含 10%~20% FBS 的完全培养基、Matrigen 胶、4％ 多聚甲醛、结晶紫染液。

1、实验前准备：

（1）细胞最好在前一天进行饥饿处理（即无血清培养基培养 1 个晚上，增强细胞迁移能力）。

（2）在 4 ℃ 过夜融化 Matrigen 胶，实验前转移到冰盒中。

（3）将 tip 头、EP 管、放有 Transwell 小室的 24 孔板和无血清培养基提前 4 ℃ 预冷，实验前转移到冰盒中。

2、基质胶铺板:

（1）稀释 Matrigen 胶：先将 8 µL Matrigen 胶加入 64 µL 预冷的无血清培养基（推荐 1:8 的比例稀释），然后用 tip 头吹打充分混匀。

（2）均匀铺胶：吸取 60 µL 稀释后的 Matrigen 胶，垂直加入 Transwewll 上室中，均匀平铺在底部。铺胶过程不要产生气泡 

（3）凝胶，Matrigen 胶放入培养箱（37 ℃，5% CO₂）中孵育 1~3 h 聚合成薄膜

（4）基底膜水化，将上室中多余液体吸掉，在每孔中加入 100 µL 无血清培养基后，于培养箱放置 30 min。

3、收集细胞，离心去上清，用无血清培养基重悬细胞，计数。不同细胞大小和侵袭能力不同，可设置浓度梯度以达到最佳实验结果。每组细胞的配制：每组 3 复孔。以每孔 10⁵ 个细胞/200 μl 的量配制 4 个复孔的用量（多配 1 孔）为例，即 4×10⁵ 个细胞/800 μl。

4、transwell 下室加入 700~800 μl 的含 10%~20% 胎牛血清的完全培养基，上室加入（3）中配制好的 200 μl 细胞。

5、细胞培养箱中培养 24~48 小时，具体需要预实验摸索下，每种细胞侵袭能力不一致。

6、固定。4％ 多聚甲醛室温 30 分钟，结晶紫染液室温染色 30 分钟，适当风干后，拍照，计数，并进行统计学分析。

1、实验前准备必须要充足，比如 4 ℃ 过夜融化 Matrigen 胶，将 tip 头、EP 管、放有 Transwell 小室的 24 孔板和无血清培养基提前一晚置于 4 ℃ 预冷。

2、处理 transwell 小室时，动作轻柔，不可暴力吹打。

3、避免产生气泡。

4、铺胶一定要均匀

5、有无血清培养基标注清楚，不要用反。

1、用棉签擦上室细胞时，容易蹭到已经穿过去的细胞，要小心操作。

2、将 transwell 小室放入 24 孔板中，接触面出现气泡。

3、细胞状态要好，不然可能不发生迁移

4、细胞接种量的问题，太多太少都会影响实验结果，建议做个浓度梯度的预实验。

5、检测时间点的选择，也需要进行预实验。