🔥 组织免疫荧光实验（IF）

免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及定量（荧光面积或平均荧光强度等）。

检测组织中某蛋白的表达，包括其表达与否、表达位置和相对含量。利用多色免疫荧光技术可同时检测多个蛋白，得到多个蛋白的共定位和表达荧光图像。

试剂：

1 x PBS 缓冲液（pH7.2~7.4）：NaCl 137 mmol/L, KCl 2.7 mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3 mmol/L，KH₂PO₄ 1.4 mmol/L；

CB：柠檬酸三钠 3 g，柠檬酸 0.4 g；

1% 盐酸酒精分化液：按体积比浓盐酸: 无水乙醇为 1:99 配制；

NGS：正常山羊血清，10% 及 1% NGS 用 1x PBS 稀释。

一抗、二抗按需选择购买，尽量参考高分文献，另可购买抗荧光猝灭封片剂。

仪器：

烤片机、通风橱、免疫组化染色缸或盒、微波炉、湿盒、荧光显微镜、微波炉。

若为冰冻切片，则进行以下步骤后直接进行第 5 步内源性过氧化物酶阻断：

一、样本处理

① 加固定剂（按下述固定剂选择固定条件：）

10% 中性缓冲福尔马林：在室温下固定 10 min；

冷冻丙酮：-20 ℃ 冷冻 10 min，风干；

甲醇：-20 ℃ 冷冻 10 min；

3% 甲醛：室温下固定 15 min；

3% 甲醛/甲醇：在 3% 甲醛溶液中室温固定 15 min，之后直接放入甲醇溶液中 -20 ℃ 固定 5 min。

② 1× PBS清洗 2 次，每次 5 min。

二、操作步骤

1、选取质量较好，厚度均匀的组织切片并做好标记，同时设立一张阴性对照切片；使用不同抗体的切片尽量选取连续切片，避免因组织差别大而影响结果分析的客观性；

2、石蜡溶解：将切片置于 70 ℃ 原位杂交仪中，烤片 30 min（无烤片条件也可忽略此步，适当增加脱蜡时间）；

3、脱蜡：将烤过后的切片迅速放入二甲苯中，2 次，各 5 min。

4、梯度水化：100%、90%、80%、70% 的乙醇中各放置 5 min，蒸馏水中放置 5 min；

5、内源性过氧化物酶阻断：滴加 3% 过氧化氢，室温于湿盒内放置 10 min 后，蒸馏水中放置 1 min；

6、抗原修复：放置于 1 x CB 中，微波炉 80% 火力 4 min，40% 火力 8 min，冷却至室温；

7、（可选步骤）0.3% Triton室温通透 15 min；

8、封闭：吸干组织周围液体，滴加 10% NGS，放置于湿盒内，37 ℃ 30 min或室温 2 小时；

9、一抗：按抗体说明书建议比例使用 1% NGS 稀释抗体；吸干组织周围液体，滴加稀释好的一抗，其中阴性对照组仅滴加 1% NGS，放置于湿盒内，37 ℃ 孵育 2 小时，或 4 ℃过夜；

10、放置于 1 x PBS 中清洗 3 次，每次 5 min；

11、二抗：吸干组织周围液体，加入稀释好的荧光二抗，室温避光孵育1h 后，1xPBS 洗三次，每次 5 min；

12、染核：加入 Hoechst 荧光染料标记细胞核，室温孵育 15 min 后 1xPBS 洗两次，每次 5 min；

13、封片：滴加一滴抗荧光猝灭封片剂于组织上，盖玻片封片，置于显微镜下观察拍照。

图1.皮肤组织多色IF结果示例图

https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-1822552/v1中Fig.4A

图2.心脏组织多色IF的结果示例图

DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.120.051583

1、若使用荧光标记的一抗，则孵育完成后，1 × PBS 清洗 3 次每次 5 min，直接进行染核和封片。

2、为了长期保存，请在 4 ℃ 下避光保存样品。

3、若无抗荧光猝灭封片剂，则滴加一滴 1 × PBS 后覆以盖玻片，置于显微镜下观察拍照，另外，注意避免长时间照射样品，防止荧光过快猝灭。

4、注意调整抗体的稀释比例，尽量按照实验室已摸索的稀释比例、抗体说明书以及文献中比例配制。

5、若想同时检测多种抗原，则需选择种属来源与样本组织不同的抗体，按抗体各自的说明书推荐终浓度混合后滴加至组织上进行孵育；二抗也按各自稀释比例混合后进行孵育，注意各荧光二抗波长需不同。

6、拍照时注意调节光强及曝光时间等参数。

1、组织细胞无着色：可能实验操作问题，包括实验操作不当、实验材料异常、抗体选择和抗体质量问题等，或者本身蛋白不表达，这些均可通过设置阳性对照以及阴性对照实验来排除。

2、染色过浅：可能由于封闭时间过长，抗体浓度过低，抗体孵育温度不当或时间过短，操作过程中缓冲液残留过多或者间接稀释抗体浓度；应根据具体原因进行调整。

3、染色过深：可能由于封闭时间过短，抗体浓度过高，抗体孵育时间过长，洗涤不充分（洗涤次数少或时间短），或者滤光片选择不合适；应根据具体原因进行调整。