免疫荧光技术

1. 标本经固定后，PBS 洗涤 3 次，3 分钟；2. 加荧光素标记的抗体，湿盒内 37 ℃ 孵育 50 分钟；3. PBS 洗涤 3 次，3 分钟；4. 0.1 % 伊文氏兰复染；5. PBS 洗 3 次，蒸馏水洗 2 次，每次 3 分钟，以除去 NaCl 结晶；6. 缓冲甘油封片，镜检。

1. 标本固定后，PBS 洗涤 3 次，3 分钟；2. 滴加一抗，37 ℃ 40 分钟，或 4 ℃ 过夜；3. PBS 洗 3 次，3 分钟；4. 滴加荧光标记二抗 37 ℃，40 分钟；5. PBS 洗 3 次，3 分钟；6. 0.1 % 伊文氏兰复染；7. PBS 洗 3 次，3 分钟；8. 缓冲甘油封片，镜检。

免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。

若在同一标本中有A和B两种抗原需要同时显示，A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用TRITC标记，可采用免疫荧光细胞化学双重染色法。

试验步骤：1）将两种显色底物1：1等体积混合（一般各1ml/membrane）。2）将混合物覆盖在膜表面，1-2分钟，摇晃使均匀。3）用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。4）在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min。5）显影、定影。6）根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。注意：荧光在一段时间后会越来越弱。2.DAB显色DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产

免疫荧光通过抗体与示踪物质结合，利用抗原-抗体结合反应，进而对抗原所在的细胞或组织进行定性或定量。免疫荧光与免疫细胞化学比较方法优点缺点免疫荧光步骤较简单，可同时标记多种蛋白，图片伪彩色观赏性强荧光容易淬灭，样品保存时间不长免疫细胞化学样品适合长期保存步骤繁琐，一次只能标记一种蛋白

免疫细胞化学与免疫细胞荧光两者实现的实验目的相似，但各有优缺点方法比较方法优点缺点免疫细胞化学样品可长期保存一次只能标记一种蛋白免疫细胞荧光步骤较简单，可同时标记不同蛋白，图片观赏性强样品保存时间较短

若为冰冻切片，则进行以下步骤后直接进行第 5 步内源性过氧化物酶阻断：一、样本处理① 加固定剂（按下述固定剂选择固定条件：）10% 中性缓冲福尔马林：在室温下固定 10 min；冷冻丙酮：-20 ℃ 冷冻 10 min，风干；甲醇：-20 ℃ 冷冻 10 min；3% 甲醛：室温下固定 15 min；3% 甲醛/甲醇：在 3% 甲醛溶液中室温固定 15 min，之后直接放入甲醇溶液中 -20 ℃

免疫荧光主要判断目的蛋白的定位，实验过程中会染表征细胞核的 DAPI。拿到免疫荧光结果，使用 PS 等软件进行 merge，如果染色结果只在 DAPI（蓝色）周围有一圈，即细胞膜定位；如果染色结果显示 DAPI 周围到处都有，即胞浆定位；如果染色结果和 DAPI 完全 merge，即细胞核定位。定量化细胞骨架：点击 Image → Type → 8-bit 可以二值化图像转换成黑白，分析骨架 An

免疫细胞化学与免疫细胞荧光两者实现的实验目的相似，但各有优缺点方法比较方法优点缺点免疫细胞化学样品可长期保存一次只能标记一种蛋白免疫细胞荧光步骤较简单，可同时标记不同蛋白，图片观赏性强样品保存时间较短