🔥 免疫荧光（Immunofluorescence, IF）
别名：Immunofluorescence technique，IF ，荧光抗体技术，蛋白定位，免疫荧光技术
最新修订时间：
合作专家 | 孙齐博士
生理学 首都医科大学
简介
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。
材料与仪器
甲醛、PBS、抗体、通透剂、BSA、荧光显微镜
步骤
免疫荧光实验的主要步骤：包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。
1、细胞准备
对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS 洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用 PBS 离心洗涤（1 000 rpm，5 min）2 次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
2、固定
使用甲醛固定细胞，固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的 PBS 中 4 ℃ 保存 3 个月。PBS 洗涤 3 次，5 min.
3、通透
使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质，通透的时间一般在 5~15 min，通透后用 PBS 洗涤 3 次，5 min.
4、封闭
使用封闭液 BSA 对细胞进行封闭，时间一般为 30 min.
5、一抗结合
室温孵育 1 h 或者 4 ℃ 过夜，PBST 漂洗 3 次，每次冲洗 5 min.
6、二抗结合
室温避光孵育二抗 1 h，PBST 漂洗 3 次，5 min 后，再用蒸馏水漂洗一次。
6、封片及检测
滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。
注意事项
细胞准备用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。
贴壁良好的细胞一般在培养时直接放入 coverslips 让细胞生长在其上即可，尽量避免使用贴壁性能不好的细胞进行免疫荧光实验，以免后续的漂洗操作引起细胞脱落。少数实验需要使用这类细胞或者悬浮细胞进行免疫荧光观察，建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
来源：丁香实验
