审核专家 | 李娜硕士
生理学 大连医科大学
简介
免疫细胞化学与免疫细胞荧光两者实现的实验目的相似，但各有优缺点
| 方法 | 优点 | 缺点 |
| 免疫细胞化学 | 样品可长期保存 | 一次只能标记一种蛋白 |
| 免疫细胞荧光 | 步骤较简单，可同时标记不同蛋白，图片观赏性强 | 样品保存时间较短 |
原理
利用抗原-抗体特异性结合的原理，一抗与样本中目标蛋白发生特异性结合，而能够与一抗特异性结合的二抗上连接有显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素），显色剂能够与显色底物结合并促使其染色，进而对细胞内抗原进行定位、定性及相对定量的研究。
用途
1、在临床上，用于病理诊断；
2、其结果可视化，能够定位目的蛋白的表达及位置（弥补Westernblot的不足）；
3、从现象出发，揭示机制；
材料与仪器
1、样品：贴壁细胞；
2、试剂：4%多聚甲醛，PBS，Triton X-100、BSA、一抗、生物素二抗、封片剂；
3、器材：6/12/24孔板、细胞爬片（盖玻片）、载玻片、湿盒。
步骤
1）按照实验要求，将细胞植于含有细胞爬片的细胞培养板，置于细胞培养箱培养；
2）植于孔板的细胞稳定过夜后，分组加药处理，到达时间后，弃掉细胞培养液，用 PBS 清洗 3 次每次 5 min；
3）加入 4% 多聚甲醛进行固定，15~20 min 后使用 PBS 清洗 3 次每次 5min；
4） 使用 0.1% 的 Triton X 100 打孔 10min，使用 PBS 清洗 3 次每次 5min；
5） 使用 0.3% 的双氧水去除内源性过氧化物酶 30 min，PBS 清洗 3 次每次 5min；
6） 使用 PBS 配制 5% 的 BSA 溶液，每孔 400~500 μL 加入目标孔中，室温进行封闭1h；
7） 吸出封闭液，加入稀释的一抗，以每孔 200 μL 加入目标孔中，4℃ 过夜；
6） 吸出一抗，PBS 清洗目标孔 3 次× 5 min。加入生物素二抗孵育1h；
7） 吸出二抗，PBS 清洗目标孔 3 次× 5 min。加入 SABC 孵育1h；
8） 吸出 SABC，PBS 清洗目标孔 3 次×5min。加入DAB 显色3-5min；
9） 吸出 DAB，PBS 清洗目标孔 1 次，将细胞爬片片取出，封片，显微镜观察，拍照。
注意事项
1、细胞孔板铺细胞爬片时，用PBS 清洗细胞爬片，并用枪头轻柔均匀往下压下细胞爬片，赶走爬片与孔板间空气，以免细胞在爬片与孔板间贴壁生长；
2、为防止细胞脱片，可预先用多聚赖氨酸处理细胞爬片；
3、参考抗体说明书使用抗体稀释比例；
4、一抗孵育选择4℃过夜孵育，样品置于湿盒；
常见问题
1、信号弱或者无信号：
1）细胞或组织样本保存时间过长；
2）抗体浓度不合适，孵育时间不足：参照抗体说明书的适当提高稀释浓度，延长孵育时间，建议 4℃ 过夜孵育；
3）试剂过期或失效，更换试剂；
2、高背景：
1）封闭不充分，适当延长封闭时间；
2）抗体浓度过高；
3）抗体孵育时间过长或温度过高；
4）清洗不充分，每步清洗 3 次每次 5 min，置于摇床清洗；
3、非特异性染色：
1）实验步骤错误，重复实验并设立阳性对照组；
2）组织中无抗原：设阳性对照以验证试验结果。
来源：丁香实验
