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细胞免疫化学:免疫酶标技术

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1 直接法

1.标本固定。
2.PBS 洗涤2×3分钟。
3.1% H2O2(或1% H2O2 甲醇)抑制内源性过氧化物,室温10~20分钟。
4.正常血清(1:10)孵育,室温20分钟。
5.滴加酶标记的抗体37℃1小时或4℃过夜。
6.PBS洗涤3×3分钟。
7.DAB+H2O2显色5~10分钟,镜下控制染色结果。DAB+H2O2应用前15分钟配制。
8.充分水洗后,复染、脱水、透明、封片、镜检。

 

2 间接法

1.标本固定。
2.PBS洗涤2×3分钟。
3.1%H2O2(或1%H2O2 甲醇)抑制内源性过氧化物,室温10~20分钟。
4.正常血清(1:10)孵育,室温20分钟。
5.滴加第一抗体,37℃1小时或4℃过夜。
6.PBS洗涤3×3分钟。
7.滴加酶标二抗,室温1小时。
8.PBS洗涤3×3分钟。
9.0.04%DAB+0.03 %H2O2显色5~10分钟。
10. 充分水洗后,复染、脱水、透明、封片、镜检。

 

3 PAP 法(过氧化物酶抗过氧化物酶抗体复合物法)

1.标定固定后,PBS洗涤。
2.1%H2O2(或1%H2O2 甲醇)阻断内源性过氧化物,室温10~20分钟。
3.PBS洗涤2×3分钟。
4.正常血清(二抗的正常血清)孵育,室温20分钟。
5.滴加一抗,室温1小时或4℃过夜。
6.PBS洗涤3×3分钟。
7.滴加二抗,室温30分钟。
8.PBS洗涤3×3分钟。
9.加PAP复合物,室温60分钟。
10. PBS洗涤3×3分钟。
11. 0.04%DAB+0.03% H2O2显色5~10分钟。
12. 充分水洗。
13. 苏木精复染,封片观察。

 

4 PAP

1~10同单PAP法。
11. 二次加酶标二抗。
12. PBS洗。
13. 二次加PAP。
14. PBS洗。
15. 0.04%DAB+0.03 %H2O2显色5~10分钟。
16. 苏木精复染核,封片,镜检。

 

5 ABC 法(卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法)

1~8同PAP法
9)加ABC液,室温60分钟。
10) PBS洗。
11) 0.04%DAB+0.03% H2O2显色5~10分钟。
12) 充分水洗。
13) 苏木精复染核,封片,镜检。

 

 

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