原理
带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
材料与仪器
切片
细胞通透液 乙醇 蒸馏水 双氧水 Triton X-100 羊血清 DAB Xylene 苏木精染液 双蒸水 中性树胶
微波炉 吹风机 组化笔 湿盒 烤箱 振荡器 染缸 光学显微镜 纯木浆卫生纸 计时器 通风橱
细胞通透液 乙醇 蒸馏水 双氧水 Triton X-100 羊血清 DAB Xylene 苏木精染液 双蒸水 中性树胶
微波炉 吹风机 组化笔 湿盒 烤箱 振荡器 染缸 光学显微镜 纯木浆卫生纸 计时器 通风橱
步骤
一. 试剂配制
1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )
9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB加双蒸水至1000 ml；1000 ml 0.2 M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH2PO4·2H2O＋58.02 g Na2HPO4·12H2O in 1000 ml双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH2PO4·2H2O：15.6 g in 500 ml ddH2O；B. 0.2 M Na2HPO4·12H2O：71.632 g in 1000 ml dH2O）。
2. Citrate Buffered Saline（0.01 M柠檬酸缓冲液，pH6.0）
28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH2O（A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g加双蒸水至1000 ml）。
3. 细胞通透液
由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100混合而成。配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷却至临用前加0.4 ml 30％H2O2。
4. 5％羊血清或封闭血清，用PBS稀释。
5. 含0.03％H2O2的0.05％DAB（避光）：用20×DAB（1％，10 mg/ml）5 ul＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。
6. 一抗、二抗均用PBS稀释。
7. Xylene、梯度Ethanol（100％x2、95％、80％、70％、50％）、双蒸水、中性树胶（封裱剂）。
8. 苏木精染液
二. 操作步骤
1. 脱蜡、水化
（1）60 ℃x20 min→Xylene 2 x10 minutes；
（2）100% absolute ethanol：2 x5 minutes；
（3）95% ethanol 2 minutes；
（4）80% ethanol 2 minutes；
（5）70% ethanol 2 minutes；
（6） distilled water：5 min；
（7）PBS洗3次x3 min。
2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶
（1）用封闭通透液浸润切片30 min（RT避光）。配法是用预热40 ml PBS加120 ul TritonX-100加热几分钟后，临用前加400 ul 30％H2O2。
（2） PBS溶液洗3次x3 min。
3、抗原修复暴露抗原决定族
（1） 切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火4 min至沸腾后，再加热约6 minx4次，每次间隔补足液体，防止干片。
4、封闭非特异性蛋白
（1） PBS溶液洗3次x3 min；
（2）将切片取出，周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min；
5、一抗孵育
（1） 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后，放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，从冰箱中取出需37 ℃复温45 min。
6、二抗孵育
（1）将一抗倒掉并用PBS洗5 minx5次；
（2） 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入37 ℃恒温烤箱中30 min（回收）。
（3）用PBS洗5次x5 min；
7、SP反应
（1） 加入SP后放入37度烤箱中30 min。
（2） 用PBS洗5次x5 min；
8、显色
（1）加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染液），显色时间控制在约5 min（3～10 min），由镜下观察颜色控制时间。
0.05％DAB（避光）（1：20储备液）：5 ul 20xDAB＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。1%DAB储备液的配制：50 mg DAB+5 ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，-20 ℃保存。
9、复染、脱水、透明、封片
（1）用PBS 3次x3min后，用双蒸水洗5 min；
（2）加一大滴苏木素染液，胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染20 s后自来水冲洗，双蒸水洗5 min，再用PBS返蓝5 min。
（3）脱水
（4）透明
Xylene 1x(1-2) min→Xylene 2x(1-2) min
（5） 封片
中性树胶。
1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )
9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB加双蒸水至1000 ml；1000 ml 0.2 M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH2PO4·2H2O＋58.02 g Na2HPO4·12H2O in 1000 ml双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH2PO4·2H2O：15.6 g in 500 ml ddH2O；B. 0.2 M Na2HPO4·12H2O：71.632 g in 1000 ml dH2O）。
2. Citrate Buffered Saline（0.01 M柠檬酸缓冲液，pH6.0）
28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH2O（A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g加双蒸水至1000 ml）。
3. 细胞通透液
由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100混合而成。配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷却至临用前加0.4 ml 30％H2O2。
4. 5％羊血清或封闭血清，用PBS稀释。
5. 含0.03％H2O2的0.05％DAB（避光）：用20×DAB（1％，10 mg/ml）5 ul＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。
6. 一抗、二抗均用PBS稀释。
7. Xylene、梯度Ethanol（100％x2、95％、80％、70％、50％）、双蒸水、中性树胶（封裱剂）。
8. 苏木精染液
二. 操作步骤
1. 脱蜡、水化
（1）60 ℃x20 min→Xylene 2 x10 minutes；
（2）100% absolute ethanol：2 x5 minutes；
（3）95% ethanol 2 minutes；
（4）80% ethanol 2 minutes；
（5）70% ethanol 2 minutes；
（6） distilled water：5 min；
（7）PBS洗3次x3 min。
2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶
（1）用封闭通透液浸润切片30 min（RT避光）。配法是用预热40 ml PBS加120 ul TritonX-100加热几分钟后，临用前加400 ul 30％H2O2。
（2） PBS溶液洗3次x3 min。
3、抗原修复暴露抗原决定族
（1） 切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火4 min至沸腾后，再加热约6 minx4次，每次间隔补足液体，防止干片。
4、封闭非特异性蛋白
（1） PBS溶液洗3次x3 min；
（2）将切片取出，周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min；
5、一抗孵育
（1） 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后，放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，从冰箱中取出需37 ℃复温45 min。
6、二抗孵育
（1）将一抗倒掉并用PBS洗5 minx5次；
（2） 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入37 ℃恒温烤箱中30 min（回收）。
（3）用PBS洗5次x5 min；
7、SP反应
（1） 加入SP后放入37度烤箱中30 min。
（2） 用PBS洗5次x5 min；
8、显色
（1）加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染液），显色时间控制在约5 min（3～10 min），由镜下观察颜色控制时间。
0.05％DAB（避光）（1：20储备液）：5 ul 20xDAB＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。1%DAB储备液的配制：50 mg DAB+5 ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，-20 ℃保存。
9、复染、脱水、透明、封片
（1）用PBS 3次x3min后，用双蒸水洗5 min；
（2）加一大滴苏木素染液，胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染20 s后自来水冲洗，双蒸水洗5 min，再用PBS返蓝5 min。
（3）脱水
（4）透明
Xylene 1x(1-2) min→Xylene 2x(1-2) min
（5） 封片
中性树胶。
注意事项
1. 苏木素复染时间需要摸索，尤其阳性染色也在细胞核上。
2. DAB显色时间需要达到最优化，镜下观察达到阳性染色明显但背景不太深。
3. 抗体孵育时间和抗体浓度需要摸索。尤其一抗孵育最好在4度过夜。
4. 切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片；用组化笔画圈时尽量画大一点，否则墨水排斥液体，引起片周边干片。
5. 片子着色不均匀的原因如下：
（1） 脱蜡不充分。可以60 ℃烤20 min，立即放入新鲜的xylene1；
（2）水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇；
（3）抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂；
（4） 抗体孵育时，切片放倾斜；
（5）抗体孵育后PBS冲洗不充分。
（6） 制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。
6. 一抗从4 ℃拿出后，为什么有人说要37度复温，目的是什么？
（1） 一方面，防止切片从4 ℃直接放入PBS易脱片；
（2）另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要,但对表达较弱的抗原可能有用,4 ℃和37 ℃度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。
7. 切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？
（1） 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制；
（2） 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；
（3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；
（4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；
（5） DAB显色时间过长或浓度过高；
（6） PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色；
（7） 标本染色过程中出现干片，易增强非特异性着色。
2. DAB显色时间需要达到最优化，镜下观察达到阳性染色明显但背景不太深。
3. 抗体孵育时间和抗体浓度需要摸索。尤其一抗孵育最好在4度过夜。
4. 切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片；用组化笔画圈时尽量画大一点，否则墨水排斥液体，引起片周边干片。
5. 片子着色不均匀的原因如下：
（1） 脱蜡不充分。可以60 ℃烤20 min，立即放入新鲜的xylene1；
（2）水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇；
（3）抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂；
（4） 抗体孵育时，切片放倾斜；
（5）抗体孵育后PBS冲洗不充分。
（6） 制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。
6. 一抗从4 ℃拿出后，为什么有人说要37度复温，目的是什么？
（1） 一方面，防止切片从4 ℃直接放入PBS易脱片；
（2）另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要,但对表达较弱的抗原可能有用,4 ℃和37 ℃度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。
7. 切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？
（1） 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制；
（2） 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；
（3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；
（4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；
（5） DAB显色时间过长或浓度过高；
（6） PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色；
（7） 标本染色过程中出现干片，易增强非特异性着色。
常见问题
在镜检前可以通过相关资料查询抗体的表达部位：细胞间质、细胞膜、细胞浆、核膜、细胞核以及在其中的多个部位表达（如：MPO抗体表达在细胞膜、细胞浆、核膜、细胞核上）和表达组织（如：VWF抗体在血管壁上表达，呈现环形）。
在显微镜下观察时，先在4倍镜下查找组织及其范围，然后查看整个组织确定阳性产物的表达部位，然后将阳性产物表达部位置于视野正中央，换高倍镜观察。
来源：丁香实验
