免疫酶标技术

免疫酶标技术

 

1）  直接法

1． 标本固定。

2． PBS 洗涤 2 × 3 分钟。

3． 1 ％ H₂ O₂ （或 1 ％ H₂ O₂ 甲醇）抑制内源性过氧化物，室温 10 ～ 20 分钟。

4． 正常血清（ 1 ： 10 ）孵育，室温 20 分钟。

5． 滴加酶标记的抗体 37 ℃ 1 小时或 4 ℃过夜。

6． PBS 洗涤 3 × 3 分钟。

7． DAB ＋ H₂ O₂ 显色 5 ～ 10 分钟，镜下控制染色结果。 DAB ＋ H₂ O₂ 应用前 15 分钟配制。

8． 充分水洗后，复染、脱水、透明、封片、镜检。

 

 

2）  间接法

1． 标本固定。

2． PBS 洗涤 2 × 3 分钟。

3． 1 ％ H₂ O₂ （或 1 ％ H₂ O₂ 甲醇）抑制内源性过氧化物，室温 10 ～ 20 分钟。

4． 正常血清（ 1 ： 10 ）孵育，室温 20 分钟。

5． 滴加第一抗体， 37 ℃ 1 小时或 4 ℃过夜。

6． PBS 洗涤 3 × 3 分钟。

7． 滴加酶标二抗，室温 1 小时。

8． PBS 洗涤 3 × 3 分钟。

9． 0.04 ％ DAB ＋ 0.03 ％ H₂ O₂ 显色 5 ～ 10 分钟。

10．  充分水洗后，复染、脱水、透明、封片、镜检。

 

 

3）  PAP 法（过氧化物酶抗过氧化物酶抗体复合物法）

1． 标定固定后， PBS 洗涤。

2． 1 ％ H₂ O₂ （或 1 ％ H₂ O₂ 甲醇）阻断内源性过氧化物，室温 10 ～ 20 分钟。

3． PBS 洗涤 2 × 3 分钟。

4． 正常血清（二抗的正常血清）孵育，室温 20 分钟。

5． 滴加一抗，室温 1 小时或 4 ℃过夜。

6． PBS 洗涤 3 × 3 分钟。

7． 滴加二抗，室温 30 分钟。

8． PBS 洗涤 3 × 3 分钟。

9． 加 PAP 复合物，室温 60 分钟。

10．  PBS 洗涤 3 × 3 分钟。

11．  0.04 ％ DAB ＋ 0.03 ％ H₂ O₂ 显色 5 ～ 10 分钟。

12．  充分水洗。

13．  苏木精复染，封片观察。

 

 

4）  双 PAP 法

1 ～ 10 同单 PAP 法。

11．  二次加酶标二抗。

12．  PBS 洗。

13．  二次加 PAP 。

14．  PBS 洗。

15．  0.04 ％ DAB ＋ 0.03 ％ H₂ O₂ 显色 5 ～ 10 分钟。

16．  苏木精复染核，封片，镜检。

 

 

5）  ABC 法（卵白素－生物素－过氧化物酶复合物法）

1 ～ 8 同 PAP 法

9） 加 ABC 液，室温 60 分钟。

10）  PBS 洗。

11）  0.04 ％ DAB ＋ 0.03 ％ H₂ O₂ 显色 5 ～ 10 分钟。

12）  充分水洗。

13）  苏木精复染核，封片，镜检。