RIP技术

【材料】细胞，抗体，磁珠 【试剂】冷PBS，RIP，RNase-free的乙醇、氯仿、异戊醇、Salt SolutionⅠ、Salt SolutionⅡ、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS、 Precipitate EnhancerRIP Wash Buffer R、IP Immunoprecipitation Buffer、RIP Wash Buffer 、0.5M EDTA 、RNase Inhibitor 【仪器，耗材】培养皿，enpendoff管，离心机，磁力架，涡旋震荡器，冰盒，枪、枪头，超净台，360°旋转仪

（一）. 细胞裂解液获取 A. 单层细胞或者贴壁细胞处理 1. 冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次 2. 加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来，收集至enpendoff管 3. 1500rpm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞 4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后于冰上静置5min 5. 每管分装200ul细胞裂解液，贮存于-80℃ B. 悬浮细胞处理：先收集细胞再计数，然后清洗裂解 C. 组织样品处理 1.冷PBS清洗新鲜切下的组织三次 2. 加入冷PBS后，用匀浆器或其他细胞分离设备使组织分散为单个细胞，计数 3. 1500rpm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞 4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后置于冰上静置5min 5. 每管分装200ul细胞裂解液，贮存于-80℃ （二）. 磁珠的准备 A. 实验前准备 1、enpendoff管 2、磁力架 3、冰盒， RIP Wash Buffer置于冰上 4、抗体，置于冰上 5、涡旋震荡器 6、枪、枪头放于超净台照射30min，枪喷DEPC水 B. 磁珠准备过程 1. 重悬磁珠 2. 标记实验所需的enpendoff管，样品包括目的样品，阴性对照与阳性对照 3. 吸取50ul 重悬后的磁珠悬液于每个enpendoff管 4. 每管加入500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡 5.将enpendoff管置于磁力架上，并左右转动15°使磁珠吸附成一条直线，去上清，重复一次 6.用100ul的RIP Wash Buffer重悬磁珠，加入约5ug相应抗体于每个样品中 7. 室温孵育30min 8. 将enpendoff管置于磁力架上，弃上清 9. 加入500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次 10. 加入500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡后置于冰上 （三）. RNA结合蛋白免疫沉淀 A. 准备工作 1、冰盒 2、360°旋转仪 3、RIP Wash Buffer 、0.5M EDTA 、RNase Inhibitor 置于冰上 B. RNA结合蛋白免疫沉淀实验过程 1.准备RIP Immunoprecipitation Buffer 2.将前上步的enpendoff管放磁力架上，去上清，每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer 3. 迅速解冻第一步制备的细胞裂解液，14,000rpm，4℃离心10min。吸取100ul上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总体积为1ml 4. 4℃孵育3h至过夜 5. 短暂离心，将enpendoff管放在磁力架上，弃上清 6. 加入500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡后将enpendoff管放在磁力架上，弃上清，重复清洗6次 （四）. RNA纯化 A. 实验前准备 1.枪、枪头、enpendoff管紫外照射30min，喷DEPC水以除RNA酶 2. Salt SolutionⅠ、Salt SolutionⅡ、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS、 Precipitate Enhancer 置于冰上 3.RNase-free的乙醇、氯仿、异戊醇 4.DEPC水置于冰上 5. 离心机预冷 6. 冰盒 B. RNA纯化过程 1.准备Proteinase K Buffer。每个样品需150ul 2.用150ul Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物 3. 55℃孵育30min 4. 孵育完之后，将enpendoff管置于磁力架上，将上清液吸入一新的enpendoff管中 5. 于每管上清液中加入250ulRIP Wash Buffer 6. 于每管加入400ul苯酚：氯仿：异戊醇，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min 7. 小心的吸取350ul上层水相，吸入另一新的enpendoff管 8. 于每管加入400ul氯仿，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min 9. 小心的吸取300ul上层水相，吸入另一新的enpendoff管 10. 每管加入50ul Salt SolutionⅠ，15ul Salt SolutionⅡ,5ul Precipitate Enhancer ，850ul 无水乙醇(无RNase)，混合，-80℃保持1h至过夜 11. 14,000rpm，4℃离心30min，小心去上清 12. 用80%乙醇冲洗一次，14,000rpm，4℃离心15min，小心去上清，空气中晾干. 13. 10-20ul DEPC水溶解，-80℃保存，送测序或进行下游实验。