免疫酶标方法

一、直接法

1．标本固定。

2．PBS洗涤2×3分钟。

3．1% H2O2（或1% H2O2 甲醇）抑制内源性过氧化物，室温10～20分钟。

4．正常血清（1:10）孵育，室温20分钟。

5．滴加酶标记的抗体37℃1小时或4℃过夜。

6．PBS洗涤3×3分钟。

7．DAB＋H2O2显色5～10分钟，镜下控制染色结果。DAB＋H2O2应用提前15分钟配制。

8．充分水洗后，复染、脱水、透明、封片、镜检。

二、间接法

1．标本固定。

2．PBS洗涤2×3分钟。

3．1% H2O2（或1% H2O2 甲醇）抑制内源性过氧化物，室温10～20分钟。

4．正常血清（1:10）孵育，室温20分钟。

5．滴加第一抗体，37℃1小时或4℃过夜。

6．PBS洗涤3×3分钟。

7．滴加酶标二抗，室温1小时。

8．PBS洗涤3×3分钟。

9．0.04%DAB＋0.03 %H2O2显色5～10分钟。

10． 充分水洗后，复染、脱水、透明、封片、镜检。

三、PAP法（过氧化物酶抗过氧化物酶抗体复合物法）

1．标定固定后，PBS洗涤。

2．1% H2O2（或1% H2O2甲醇）阻断内源性过氧化物，室温10～20分钟。

3．PBS洗涤2×3分钟。

4．正常血清（二抗的正常血清）孵育，室温20分钟。

5．滴加一抗，室温1小时或4℃过夜。

6．PBS洗涤3×3分钟。

7．滴加二抗，室温30分钟。

8．PBS洗涤3×3分钟。

9．加PAP复合物，室温60分钟。

10．PBS洗涤3×3分钟。

11．0.04%DAB＋0.03 %H₂O₂显色5～10分钟。

12．充分水洗。

13．苏木精复染，封片观察。

四、双PAP法

1-10．同单PAP法。

11．二次加酶标二抗。

12．PBS洗。

13．二次加PAP。

14．PBS洗。

15．0.04%DAB＋0.03 %H₂O₂显色5～10分钟。

16．苏木精复染核，封片，镜检。