常规方法

干细胞的研究也需要从分子生物学水平上进行，一些基本的分子生物学实验，如凝胶电泳、载体的构建、转染细胞等，在干细胞实验中也频繁用到。由于生命科学研究的发 展 ，分子生物学研究技术也越来越多，越来越完善，分子生物学实验指南就概括了所有基本的实验操作，各种反应试剂盒的出现使实验操作更加简便，也提高了实验的效率。本节就干细胞实验中用到的常规操作进行简单的描述。

细 胞 组 分 的 提 取

细胞组分的提取主要包括核酸的提取、蛋白质和细胞器的提取 (奥斯伯等 2001)。核酸的提取又包括 D N A 的提取和 R N A 的提取。D N A 的提取中常用的是细菌质粒 D N A 的提取和细胞基因组 D N A 的提取。

D N A 的提取

质 粒 D N A 的提取

质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒 D N A 分子。其基本原理为：当菌体在 N a O H 和 S D S 溶液中裂解时，蛋 白 质 与 D N A发生变性，当加入中和液后，质 粒 D N A 分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中，蛋白质与染色体 D N A 不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。质 粒 D N A 的提取可分为小量制备质粒 D N A 和大量制备 D N A 。小量制备 D N A 采用Promega 公 司 的 Plus S V Minipreps D N A 纯化提取试剂盒，大量制备 D N A 采用碱裂解法以及氯化铯/溴化乙锭平衡离心法，碱裂解法可能是最常用的质粒制备方法，该法不仅相当快捷可靠，而且可获得相当纯净的粗制 D N A ，而氯化铯/漠化乙锭平衡离心法则可以得到除去了大多数杂质的高纯度质粒 D N A 。但它需要使用溴化乙锭，并且需要长时间的超速离心来形成密度梯度。

1 ) 小量制备

质 粒 D N A 的小量制备主要采取 Promega 公 司 的 D N A 小量提取试剂盒 (WizardR PlusS V Minipreps D N A Purification System)

(I) 材料：含 抗 生 素 的 L B 琼脂糖平板、含 抗 生 素 的 L B 的培养液、 9 5 % 乙醇、离心 机 、 1.5 ml E p 管 。

⑵ 方 法 (图 6.1):

a. 从 L B 琼脂糖平板上挑选单克隆菌落，转 入 1〜 IOml L B 培养液中培养。对于高拷贝质粒，建议培养液不要超过 5m l ，因为培养液再多，由于试剂盒的微型柱的限制，质 粒 D N A 的得率不会再有提高；对于低拷贝质粒，可多加培养液，但 不 要 超 过 IOml, 因为培养液过多很容易导致细胞裂解液难以有效分离和质粒D N A 的污染

b.将培养管在摇床中 3 7 ℃ 过夜培养，培养时间可以根据培养液容量进行最优化以提 高 质 粒 D N A 的得率，但如果培养时间过长，则会由于细菌营养不良、老化而死亡、裂解导致质粒 D N A 的得率下降。

c. 收 集 l——5 ml(高拷贝质粒) 或 IOml(低拷贝质粒滴液于1.5 ml E p 管中， 1 〇〇〇 g 离心 5 min，弃上清，将 E p 管倒置于吸水纸上以除去残存的液体。

d.加入 2 5 0 ul 细胞重悬液，剧烈振荡将沉淀重悬，这一步非常重要，一定要完全重悬细胞。

e.再 加 入 2 5 0 ul细胞裂解液，轻轻颠倒混勻 4 次 ，静 置 l——5 min 至细胞悬液变清。

f.加 入 1 0 0 碱性蛋白酶液，颠倒混勻 4 次 ，室温静置 5 min。
g.加入 350 ul中和液，然后立即颠倒混勻 4 次 。

h.室 温 、14 00g离 心 1 〇 min。

i.将圆形柱放入 2m l 的收集管中，每个样品一套。

j.将 步 骤 h 离心后的上清液移入步骤 i 的圆形柱中，注意不要移入白色沉淀。

k.室温、 14 OOOg 离 心 lmin，拿开圆形柱，将收集管中的液体倒掉，再将圆形柱放入收集管中。

l.向圆形柱中加入 750 ul 用 95% 乙醇稀释的清洗液。

m.重复步骤 k 。

n.用 2 5 0 ul 柱洗液重复清洗步骤。

o.室 温 、 14 OOOg 离心 2 min。

P.将圆形柱转移到一个新的 1.5 ml 的 E p 管 中 ，注意圆形柱不要带有柱洗液，如果有的话就室温下 14 OOOg 再 离 心 lmin。

q.向 圆 形 柱 中 加 人 1 〇〇u;双蒸水，室 温 下 14 OOOg 离 心 lmin，以 便 质 粒 DNA 从圆形柱中洗脱。离心后弃去圆形柱。

r . 测定质粒 DNA 的浓度， - 2 0 ℃或更低温度保存。

2) 大量制备

(1) 材 料 ：带 有 质 粒 的 大肠杆菌菌株、含 有 适 当 抗 生 素 的 L B 培 养 基 、葡萄糖/Tris/EDTA 溶液、卵清溶菌酶、 NaOH/SDS 溶液、 pH 约 5 .5 的 3mol/L 乙酸钾溶液、异丙醇、 TE 缓冲液、 CsCl、 10 mg/ml 溴化乙锭溶液、 DowexAG50W-X8 阳离子交换树脂、
CsCl/ TE溶 液 ： 100gCsCl 溶 于 100mlTE 缓 冲 液 中 、TE 缓冲液/0.2mol/L NaCl,100% 乙醇 和 70% 乙醇。

⑵ 方 法 ：
a.往 2L 烧瓶中加入 500 ml 含有适当抗生素的 L B 培养基，然后加入 5 ml 过夜培养的带有所需质粒的大肠杆菌培养物，再 于 3 7 ℃培养至饱和状态。

b. 4℃ 、 6000 g 离 心 IOmin， 用 4 ml G T E 溶液重悬沉淀，并转移到一个容积不小于 20m l 的高速离心管中。

c. 加 入 Iml 新配的含 25m g /m l 溶菌酶的 G T E 溶 液 ，重悬沉淀，于室温放置 l 〇 min。

d . 加 入 IOml 新 配 的 NaOH/SDS 溶液，并且轻轻混勻直至液体变得均一、清亮而黏稠，于冰上放置 l 〇 min。

e . 加 入 7.5 ml 乙酸钾溶液，用吸管轻轻搅拌直至黏稠度下降并形成大的沉淀，于冰 上 放 置 IOmin。

f. 4 ℃ 、 2000 g 离 心 IOmin, 将上清轻轻倒入另一个干净的离心管中，如果有可见的漂浮物可用数层纱布过滤。

g. 加 入 0.6 倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置 5〜 10 min。

h.室 温 、 1500 g 离心 10 min。

i.加入 2 ml 70% 乙醇轻轻洗涤沉淀，然后短暂快速离心，吸去乙醇，并真空干燥。

j.将沉淀溶于 4 mlTE 缓冲液中，加 人 4.4 gCsCl， 溶解后，再 加 入 0.4 mllOmg/ml 溴化乙锭

注意:、溴化乙锭是一种诱变剂并能造成环境污染，操作时应戴手套，并且妥善处理。

k.将溶液转入一个 5m l 的 qUick-seal 快速封口的超离心管中，酌情往管中加入CsCl/T E 溶液，封好离心管， 2 0℃ 、 500000g 离 心 3.5h或 2 〇℃ 、 350000g 离心4 h 以上。

l.首先从管的顶端插入一支 20 G 针头，然后用带另一 20 G 针 头 的 3m l 注射器将质粒带吸出

注意：为了防止紫外线对眼睛的严重损伤，应戴紫外防护眼镜或面罩。操作溴化乙锭时要戴手套。

m.进行第二次超速离心 (步骤 k 和 1)，除去混杂的 R N a 和染色体 D N A 以获得更高纯度的质粒。

n. 将 质 粒 D N A /E B 溶液的 1.5〜2 倍体积装 Dowex A G 5 〇 W -X 8 柱 子 ，用数倍体积的 T E /0.2mol/L NaCl 溶液清洗和平衡柱子。

o. 用注射器将混有溴化乙锭的质粒 D N A 溶液直接加到树脂的顶部，注意不要摇动树脂。

P立即收集流出液，然 后 用 2 倍于上样体积的 TE/0.2mol/L N a C l 溶液洗脱柱子 2次 。

q.加 入 2 倍 体 积 100% 乙醇于室温或一 20℃沉淀质粒 D N A 。4℃ 10 0 00g 离心IOmin

r. 沉 淀 用 7 0 % 乙醇洗涤 1 遍 ，真空干燥，溶 解 于 T E 缓冲液，并 于4℃ 保 存 。

基 因 组 D N A 的提取

基因 组 D N A 的提取主要采用的是 Promega 公司的基因组 D N A 提取试剂盒 (WizardR D N A Purification Kit)

I) 造血干细胞及血细胞基因组的提取

(1) 材 料 ： 5 〇 m l 离心管，异丙醇， 7 0 % 乙醇， 37℃ 和 65℃ 水 浴 。

(2) 方法：

a. 向 50m l 离心管中加入 30m l 细胞裂解液。

b.轻轻摇晃装有血液的管子让血液混匀，然后将样品 (IOml) 加入含有裂解液的离心管中，颠 倒 5〜 6 次混匀。

c.室温下静置 IOmin 以充分裂解细胞，然后室温、 2000 g 离 心 l 〇 min 。

d. 在不触及肉眼可见的白色沉淀的基础上尽可能吸弃上清，尽管这样，还会有大约 1.4m l 的液体残留。

e. 剧烈振荡离心管直至沉淀全部重悬。

f. 向离心管中加入 IOml 核裂解液，吹打溶液 5——6 次以便细胞充分地裂解。溶液这时应该非常黏稠，如果仍有细胞团存在，那么将离心管放入 37℃温箱中直至细胞团溶解。如 果 放 入 温 箱 I h 后仍有细胞团，那就再加入 3m l 核裂解液，然后再放入温箱中至细胞裂解。

g. 加 入 RNase A 至终浓度为 20ug/m l , 将离心管颠倒 2〜 5 次 ，然后将离心管放入37℃ 温 箱 15 min，然后取出冷却至室温。

下 ， 13 000——16 OOOg 离心 lmin。

j.小心地吸弃乙醇。由 于 D N A 沉淀非常松散，在吸弃乙醇时要避免将沉淀吸入移液管中。

k.将 E p 管倒置在吸水纸上，室温干燥沉淀 10—— 15 min。

1.向离心管中加入 800 ul DNA 再水化液，在 65 丈水浴锅中孵育 I h 或 过 夜 ，让 DNA 再度水化，期间间歇性地轻轻敲打离心管使沉淀溶液充分混合。

m.2——8℃ 保存基因组 DNA。

3 ) 酵母基因组 D N A 的提取

( 1 ) 材 料 ：YPD 肉汤培养基、，5 〇 mmol /L EDTA(pH 8.0)、 2 20mg/mL 裂 解 酶 、异 丙 醇 、7 〇% 乙醇、 1.5mIEp 管 、 37¾ 和 6 5 ℃水浴。

⑵ 方 法 :

a.从在 Y P D 肉汤培养基中培养 2 0 h 的培养液中取 Im I 放 入 1.5 ml E p 管中

b.室温、 13 000〜 16 OOOg 离心，吸弃上清。

c.加入 293 叫 50 mmol/L E D T A ，使沉淀彻底重悬。

d. 加 入 7.5ul 20m g /m l 的裂解酶液，轻轻摇晃 E p 管 4 次使溶液混合。

e. 将样品放入 37 ℃温箱中孵育 30〜 60 min，让细胞壁彻底消化，然后冷却至室温。

f。13 000〜 16 OOOg 离心 2 min，弃上清

g. 向 E p 管中加入 300ul 的核裂解液，轻轻颠倒 E p 管混合。

h. 再 加 入 IOOul 蛋白质沉淀液，高速剧烈振荡 20s。

i . 冰上静置 5 min。

j. 13 000——16 OOOg 离心 3 min。

k. 将上清移入一个新的 E p 管中，并 加 人 3 0 0 ul 异丙醇。

1.轻轻地混合溶液直至白色的丝状 D N A 形成可见的团块。

m. 13 000〜 16 OOOg 离心 2 min

n. 小心弃去上清，用吸水纸吸干残余液体，然 后 向 E p 管中加入 3000 7 0 % 乙醇，轻轻颠倒 E p 管 ，让乙醇清洗 D N A 沉淀。

o. 13 000〜 16 OOOg 离 心 2 min。 小心弃去乙醇。

P.用吸水纸吸去多余液体，空气中干燥沉淀 10——15 min。

q . 向 E p 管中加入 50ul D N A 再水化液。

r. 加 入 1.5 ul 的 R N a s e 液以纯化 D N A 样品。剧烈振荡样品 ls，高速离心 5s，收集 液 体 3 7 1 孵 育 15 min。

s. 65上升到水浴锅中孵育 I h 或 4 ¾ 过夜，让 D N A 再度水化，期间间歇性地轻轻敲打离心管使沉淀溶液充分混合。

t. 2〜 8上升到保存基因组 DNA。

R N A 的 提 取

分离纯净、完 整 的 R N A 分子对于干细胞的分子生物学方面的实验是很重要的，是进行基因表达分析的基础。 R N A 可以拷贝成双链 D N A ，并克隆，最终获得相应于干细胞 的 c D N A 文库。对 R N A 结构和生物合成的分析有助于干细胞基因表达的研究。本节只简单介绍 Trizol 法提取干细胞总 R N A ，参考了 Invitrogen 公 司 的 Trizol 操作手册。

1 ) 材料

口罩，手 套 ， D E P C 水 ， E p 管 ，枪头， D E P C 水高压后配制的 7 0 % 乙醇。

2 ) 方法

(1) 去离子水配制 D E P C 水 。

(2) E p 管 ，枪头完全浸泡于 D E P C 水中，过夜后取出高压，烤干后使用。

(3) 浸泡后的 D E P C 水高压后还原成无 R N A 酶的水， 4 ℃ 保存。

(4) 25c m ² 培 养 瓶 内 细 胞 ，如果是 贴 壁 细 胞 ，吸 弃 培 养 液 ，加 人 Iml Trizol 液吹打 细 胞 至 细 胞 脱 落 ；如果是悬浮细胞，将 溶 液 离 心 后 去 上 清 ，加 入 Iml Trizol 吹悬沉 淀 。

(5) 加 入 0.2ml 氯仿/ml Trizol，剧 烈 振 荡 15s，室 温 静 置 1 〇 min 。

(6) 4℃ 、 12 OOOg 离 心 15 min，离心后溶液分为 3 层 ，下层为酔/氯仿层，中间为蛋白质层，无色水相的上层是 R N A 层 ，占溶液总体积的 6 0 % 。

(7) 吸取最上层入一新 E p 管 ，注意勿将中间层的蛋白质吸出。

(8) 加 入 0.5m l 异丙醇/ml Trizol 液 ，颠倒混勻，静 置 lOmin。

(9) 4℃ ；、 12 OOOg 离心 lOmin。

(10) 弃上清，加 入 Iml 7 5 % 乙醇/ml Trizol 液 ，轻轻混匀勿振荡，用于洗涤 R N A 沉淀。

(11) 4℃ 7500 g 离心 5 min。

(12) 弃上清，小心吸去 E p 管壁的乙醇，室温干燥。

(13) 加入步骤 (3) 中的 D E P C 水 30——4 〇 ul 溶解沉淀。

(14) 步骤 (13) 得到的溶液用核酸分析仪检测浓度以及纯度。

(15) - 2 0 ℃ 或更低温度保存提取的 R N A 溶液。

蛋 白 质 和 细 胞 器 的 提 取

1 ) 原理
蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理有两方面：①用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；②将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳、超速离心、超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱 、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下三个阶段：细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓缩、干燥和保存。

2 ) 材料

① 超 声 波 ；② 0.02〜 0.05mol/L 磷酸盐和碳酸盐；③凝胶过滤层析柱及相应的介质和缓冲液；④装柱配套用具或凝胶 C 槽 ；⑤缓冲液槽；⑥ 蠕 动 泵 ；⑦ U V 紫外检测器；⑧ 分部收集器；⑨ Diaflo 超滤膜。

3 ) 方法

⑴细胞的破碎及细胞器的分离：将细胞在-20 丈以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎，差速离心弃去部分杂质。

(2) 蛋白质的粗提：向溶液中加入磷酸盐和碳酸盐 (磷酸铵和碳酸铵)，随着盐浓度的升高，蛋白质从溶液中析出，收集沉淀。

(3) 在盐析蛋白质的同时准备凝胶过滤层析柱，如果凝胶过滤的介质是干粉，则需在凝胶过滤缓冲液中完全溶胀。切勿用磁力搅拌器搅拌，让凝胶颗粒自然沉降，吸去或倾去不沉降的细小颗粒，或者根据厂商的使用指南进行处理。对预溶胀的凝胶，在布氏漏斗或玻璃烧结漏斗中用大量缓冲液洗去防腐剂。重悬于等体积的凝胶过滤缓冲液，倾人细颈过滤瓶中，使用前进行脱气。
在远离过往通道及直接光照的恒温环境，将层析柱垂直安装在稳固的实验室支架上。用一注射器将凝胶过滤缓冲液从柱子的输出管注入柱子，至缓冲液达到柱子支持体平面之上，注射器留在输出端以堵住柱子。
沿着一根顺柱子内壁而放的玻璃棒将凝胶混悬物倒人柱子至所设高度，再小心往凝胶顶部加入 I c m 高的一层缓冲液，并连接缓冲液储存容器，取去堵着柱子输出管的注射器 ，用 2〜 3 倍柱床体积的缓冲液洗柱子。

(4) 流尽柱子凝胶顶部上面的缓冲液，关 闭 其 输 出 管 。加 人 相 当 于 柱 床 体 积 1%——5%的蛋白质样品。开放输出管，让样品流进柱床，凝胶上面的柱子内壁以缓冲液冲洗，然 后 在 凝 胶 顶 上 用 吸 管 加 入 I c m 高的缓冲液层，重新与缓冲液储存容器连接，开始洗 脱 。

(5) 分 部 收 集 流 出 液 。每分部相当于 1 % 总柱床体积，分别测每分部的 A ₂₈₀, 并各取小份样品测生物活性。选出有活性的分部用 SDS-PAGE 检测所含蛋白质的数量和质量。合并所需蛋白质的部分。

(6) 用 2〜 3 个柱床体积的凝胶过滤缓冲液洗柱，柱子保存在含 0.02% 叠氮化钠的缓冲液中，柱子可无限次使用。

(7) 步骤 (5) 所得蛋白质相对较稀，将溶液放入 Diaflo 超滤膜中进行浓缩。

(8) 紫外分光光度计测蛋白质的浓度，溶 液 4℃ 保存。

核 酸 杂 交

核酸分子杂交分子单链之间的互补碱基通过非共价键 (主要是氢键) 的形成即出现稳定的双链区。分子杂交可在 D N A 与 D N A 、 R N A 与 R N A 或 R N A 与 D N A 的两条单链之间进行 (奥斯伯等 2001)。核酸分子杂交按作用环境分为固相杂交和液相杂交。固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条游离在溶液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。固相杂交时，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上的杂交物有容易检测和能防止靶 D N A 自我复性等优点，故该法最为常用。常用的固相杂交的类型有菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹、 Northern 印迹、组织原位杂交和夹心杂交等。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。

 

11) 倒掉杂交管中 A P H 溶 液 ，换上预热 (68¾) 的 A P H 溶 液 ，加人变性探针， 6 8℃滚动下杂交过夜。

(12) 倒 掉 A P H 液 ，加人等体积的 2xSSC/0.1%(m /V)S D S ，室温下滚动孵育 lOmin，5 min 后更换洗膜液。

(13) 倒掉 2xSSC/0.1%(m /V)S D S ，换上等体积的 0.2xSSC/0.1%(m /V)S D S ，重复步骤(12)

(14) 必要时，在 42T ：用 0.2xSSC/0.1%(m /V)S D S 进 行 15m i n 的中等严谨度的洗膜 2 次。

(15) 必要时，在 6 8 1 用 O.lxSSC/0.1%(m /V)S D S 进 行 15m i n 的高度严谨度的洗膜 2 次。

(16) 倒掉洗膜液，室温下 2x S S C 漂洗膜，吸干多余液体，用塑料膜包裹后放射自显影

(13) 将润湿了的膜放在凝胶表面，排去气泡，以 20x S S C 流洗膜表面。切 5 张与膜大小相当的 Whatman 3M M 滤纸，放于膜的表面，然后将切得与膜大小相当的纸巾整齐地堆放在滤纸的表面，高 约 4c m 。

(14) 在纸堆的顶部放一块玻璃平板，压一重物，放置过夜。

(15) 拆卸转移用的滤纸、海绵等，回收膜和压扁了的凝胶。在膜上用铅笔标上加样孔的位置和方向。

(16) 用 2x S S C 洗 膜 ，然后放在一张 W h a t m a n S M M 滤纸上，让膜完全干燥。

(17) 将 膜 夹 在 2 张 Whatman 3M M 滤纸中间， 8 0 ℃真 空 烤 膜 2 h 。

(18) 如果需要的话，凝胶可按步骤 (5)，用溴化乙锭染色以检查转印效率。

(19) 制备放射比活在 10⁸dpm/ug 以上的寡核苷酸探针，并除去未标记的寡核苷酸。

(20) 用 6x S S C 液润湿携带 R N A 的膜。

(21) 将 膜 带 R N A 的面朝上，放入杂交管中，每 IOcm2 膜 面 积 加 入 I m l 甲酰胺预杂交液/杂交液，旋 转 保 温 3 h ，温度设定在 42℃ (D N A 探针) 或 60℃：(R N A 探针)。

(22) 如果是双链探针的话，需在水浴或加热器中加热至 100SC，保 温 lOmin，置于冰上。

(23) 吸所需要体积的探针加人杂交管中， 42℃ (D N A 探 针 烕 60℃ (R N A 探针) 过夜。

(24) 倒出杂交液，按以下程序依次洗膜：

2xSSC/0.1%S D S 室温旋转洗涤 5 minx2 次 ；
0.2xSSC/0.1%S D S 室温旋转洗涤 5 minx2 次 (低严谨度洗涤)；
在 42℃ 用 0.2xSSC/0.1%(m /V)S D S 洗 涤 15 minx2 次 (中严谨度洗涤，可选)；
在 68℃用 0.1xSSC/a i %(m /V)S D S 洗 涤 15 minx2 次 (高严谨度洗涤，可选)。

(25 ) 在 室 温 以 2X S S C 洗 膜 ，吸干多余液体，盖上可透过紫外线的塑料保鲜膜，进行放射自显影。

逆 转 录

1 ) 原理
逆转录技术就是利用逆转录酶的活性，以 R N A 为 模 板合成 c D N A 的技术 ， 一 般情况下提取的 R N A 经过逆转录后紧接着就进行 P C R 反 应 ，所以逆转录、 P C R 技术的组合就 是 R T -P C R 技术。

2 ) 材料
模板 R N A 、 5x A M V buffer、 2.5 mmol/L d N T P 、 RNase 抑制剂 (40U /ul)、 200ug/ml oligo d T 、 A M V R T N a s e (5U /ul)、 D E P C 处理水、 P C R 管和 P C R 仪 。

3 ) 方法

(1) 取 PCR尺管加入 0.5 ul 模 板 RNA、 1 ul oligo d T,5ul处理水。

⑵ 将 P C R 管 7 0 ℃ 水 浴 lOmin。

(3) 取出冰浴 2 min。

⑷ 再 向 P C R 管中加入4ul 5x A M V 缓冲液、8 ul d N T P 、0.5ul R N a s e 抑制剂、1 ul A M VRTNase, 离心混匀。

ELISA

1 ) 原理

酶联免疫吸附反应 (ELISA) 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本 (测定其中的抗体或抗原) 与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

常 用 ELISA 方法有：双抗体夹心法测抗原、双抗原夹心法测抗体、间接法测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原、捕获包被法测抗体、 ABS-ELISA 法 。

2 ) 材料

① PBS(pH 7.3);② 包被液 [0.1mol/LNa2CO3 (pH9.6) 以及 0.02% 叠氮化钠];③洗脱液[0.9% NaCl-0.05% Tween 20(N a C l/T )];④ PBS-T A [PBS-Tween 20(0.05%)-叠氮化钠 (0. 02%)p H 7.3];⑤ A P (碱性磷酸酶) 缓冲液 [0.05mol/L Na2C 0 3-0.001mol/L MgCl2 (p H 9.3)];⑥ H R P (辣根过氧化物酶) 底物 [混合等量的四甲基联苯胺 (T M B ) 底物以及 T M B 过氧化物酶溶液]。
注意：①叠氮化钠不能用来反映 H R P 的变化；②洗脱循环步骤对于清除背景干扰非常重要。

3 ) 方法

⑴ 将 含 有 抗 原 (5〜 20ug/ml) 的包被液加入到塑料管或微型皿中 (目前常用的是 Linbro微孔板或 C 〇 starSer 〇 d u Ster「U 」聚乙烯微孔板)。 37℃ ：孵 育 4 h ，4℃保 存 (可 保 存 2 周)。
如果是聚乙烯微孔板，用 洗 脱 液 洗 3 次 ，然后吸水纸吸干多余的液体，封闭好- 7 0 ¾ 保存 ，一般情况下聚乙烯微孔板可保存 6 个月。

⑵ 酶 标 抗 体 的 准 备 ：
a. 8000 g 离心 0.3 ml 碱性磷酸酶 (A P ， SigmatypeVII， 1140U /ml)2 min。

b. 沉 淀 中 加 人 0.1m l 亲和纯化的特异性抗体 (动物特异性，细菌特异性)，这样酶和抗体的比例是 3 : 1。

c. P B S 透析过夜。

d. 加 入 IOul 的戊二酸 (glutaraldehyde) 让溶液终浓度为 0.2%。

e. 室温下孵育 2 h ，稀 释 到 lml，然 后 P B S 透析过夜。

f.用 0.05mol/L Tris-5% B S A -lmmol/L MgCl2-0.02% N a N 3 稀释到 10 ml。

g . 4 ℃ 保 存 。

(3) 试管和平皿用洗脱液洗 3 次 ，每 次 间 隔 lOmin，清洗过程中要确保每个孔都充满了洗脱液。

⑷ 用 0.5%B S A 完全填满试管和平皿 I h 以封闭试管和平皿。

⑶ 再 用 洗 脱 液 清 洗 4 次 ，静 置 10——15 min。

(6) 每个孔里加人 1004 P B S - T A 稀释的抗血清，室温静置 5 h 或者冰箱中过夜。通常情况下， 1:1 〇〇的稀释比例就足够了，如果是单克隆抗体就不要稀释。

(7) 重复步骤 (4)，然 后 加 人 PBS-T A 稀释的酶标抗体，如 果 是 A P 标记抗体，室温下 孵 育 牝 ，如 果 是 H R P 标记抗体，室 温 下 1.5 h 或 3 7 ℃ 、 lh。稀释比例一般是 1 : 1000。

(8) 重复步骤 (4)，然后每孔加入 lOOul 底 物 。对 于 A P 酶标抗体：底物溶液是溶于缓 冲 液 的 终 浓 度 lmg/m l 的硝基磷酸 (p-nitrophenyl phosphate) , 显 色 IOOmin 后 用 IOpl
Imol/ L N a O H 终止反应， 4 〇 5nm 波长测吸光度。对 于 H R P 酶标抗体，则应向孔中加入等 份 的 T M B ，待达到既定强度后用 IOOuI lm 〇 l/L 磷酸溶液终止反应， 450n m 波长下测吸光度。

E L I S A 反应流程简图如图 6.4 所示。

免 疫 组 化

1 ) 原理
免疫组织化学是基于利用放射性核素和其他标记物 (萤光素、酶 、重金属离子等)作 为 示 踪 剂 ，通过免疫亲和 (抗原-抗体特异性结合) 和核酸杂交 (碱基配对特异性连接)途 径 ，在组织切片或细胞涂片上，原位显示生物大分子的动态变化而建立的一门染色技 术 。

2 ) 材料
①过氧化物酶标记的链霉素卵白素染色 (s p 系列) 试剂盒；② 试 剂 1[封闭用正常血 清 ，工 作 液 3m l 、6 ml、15 ml(蓝色液体)];③试剂 2[生物素化二抗工作液 (IgG/Bi0)3m l 、6m l 、 15 ml(黄色液体)];④ Sp-9000: 通用型生物素标记羊抗兔、大 鼠 、小鼠和豚鼠
IgG; ⑤ Sp-9001: 生 物 素 标 记 羊 抗 兔 IgG; ⑥ Sp-9002: 生 物 素 标 记 羊 抗 小 鼠 IgG;⑦ 试 剂 3[辣根酶标记链霉素卵白素工作液 (S-A /H R P )3 ml、 6 ml、 15 ml(橙色液体)]、荧光显微镜。

3 ) 方法
采用北京中杉公司免疫组化试剂盒 (Histostain™-Plus Kits) 操作步骤。

(1) 石蜡切片，常规脱蜡至水。

(2) 3 % 过氧化氢孵育 5——10 min, 以除去内源性过氧化物酶的活性。

⑶ 蒸 馏 水 冲 洗 ， P B S 浸 泡 5 min(如果需要采用抗原修复，在此步骤之后进行)。

⑷ 滴 加 试 剂 1(蓝 色 液 体 )，室 温 孵 育 10〜 15 min，倒去液体，勿洗
。
⑶滴加适当比例稀释的一抗， 37℃孵 育 1〜 2 h 或 代 过 夜 。

(6) PBS 冲洗， 5 minx3 次 。

(7) 滴加试剂 2(黄色液体)，室 温 或 37T 孵 育 10——15 min。

(8) 重复步骤 (6)。

(9) 滴加试剂 3(橙色液体)，室 温 或 3 7 1 孵 育 10〜 15 min。

(10) 重复步骤 (6)。

(11) 显色剂显色 (D A B 或 A E C )。

(12) 自来水冲洗，复染，封片。切片可以于暗处 2 - 8 ℃ 保存。

(13) 显微镜下观察，记录结果。

此 外 ，干细胞研究中还有其他的实验技术，如微阵列、免疫共沉淀、质谱分析技术、蛋白质芯片技术、酵母双杂交技术、 R N A 干涉等。