干细胞增殖分化调控研究范例 -- 由生命现象到功能分子

干细胞增殖分化调控研究范例 -- 由生命现象到功能分子

CD3 4 分子是公认的造血干细胞阳性标志，此外，不表达造血细胞各分化系表面标志的细胞也是分化上更为原始的细胞，即 Lin^- 细胞。目前临床和基础研究中分离造血干细胞的方法都是针对 CD3 4 分子来进行的。然 而 ，动物体内的造血重建实验证实，不论是小鼠 还 是 人 在 Lin^-TCD34^-细胞群中都含有具有自我更新和多系分化能力的造血干细胞，而且在造血细胞发育过程中 Lin^-CD34^-细胞 比Lin^-CD34⁺细胞更原始，因 此 Lin^-CD34⁺细胞很 可 能 是 由 Lin^-CD3^T细胞发育而来的。进一步研究还发现Lin^-CD34^-造血干细胞在重建造血、增殖潜能、转染能力方面都优于Lin^-CD34⁺造血干/祖细胞。通 过 对 Lin^-CD34^-和 Lin^-CD34⁺这两群非常相近的细胞的基因表达情况进行比较，找 出 Lin^-CD34^- 细胞特异表达的、可能与其性状相关的基因，将为其临床应用提供理论依据。

根据已知的现象差异，王冬梅等人采用抑制消减杂交的方法建立了 LinV
^-CD34^-细胞与 Lin^-CD34⁺细 胞 的 cDNA消减文库，从中找出了 Lin^-CD34
^-胞特异表达的、可能与其性状相关的基因(王 冬 梅 2003)。

实验原理

抑 制 消 减 杂 交 技 术 (suppressionsubtractivehybridization, SSH)通过寻找差异表达的基因以实现对功能、表型差异的机制分析(Diatchenko et al. 1996)。
SSH是一种以抑制性PCR反应为基础的新 型 CDNA消减杂交方法。将两种含有末端重复序列的不同接头分别连接于等量的两份待消减实验方(tester)cDNA的末 端 ，并将两者同过量的消减用的驱动方(driver)cDNA进行杂交，第一轮杂交后将两份杂交产物合并进行第二轮杂交 ，最后以杂交产物作为模板进行PCR扩 增 ，扩增产物即为差异表达CDNA片段 。特殊设计的引物能抑制同一份样品内自身退火的cDNA片段的扩增，即所谓的抑制性PCR技 术 ，它可以选择性扩增差异表达的目的cDNA片 段 ，而抑制非差异片段的扩增(图6.5)

主 要 设 备 与 试 剂

PCR 仪 、 Trizol®试剂盒(Gibco B R L )、 SMART™ PCR cDNA 合成试剂盒(aontech)、PCR纯化试剂盒(Promega)、 PCR-Select™cDNA消减试剂盒(Clontech)、 DNA快速纯化回收试剂盒(博大泰克)、 pGEM®-T Easy Vector System(Promega)。

实 验 步 骤

两 种 细 胞 总 R N A 的 提 取 (参 见 6.4，细 胞 组 分 的 提 取）

S M A R T P C R 合 成 并 扩 增 双 链 c D N A

第一链 cDNA 合成
将以下试剂混合在一个P C R 管中：
RNA 2ug

c D N A 合成引物(lOumol/L ) 1ul

S M A R T II寡核苷酸(loumol/L ) 1ul

去离子水 1ul

总体积 5ul

涡旋混匀并短暂离心，置 P C R 仪中， 7O℃ 、 2 min，短暂离心使样品沉在管底后加入以下试剂：

5X第一链buffer 2ul

DTT(20 mmol/L) 1ul

50xdNTP(10 mmol/L) 1ul

Superscript II 逆转录酶(200U /nl) 1ul

涡旋混匀并短暂离心，置 P C R 仪 中 ， 42℃ 、 1.5 h 。 加 人 4 〇ul T E 稀释合成的第一链cDNA， P C R 仪 中 ， 72℃、 7m in灭活逆转录酶 。 样品储存于-20℃

TE 10 mmol/L Tris pH7.6

lmmol/L EDTA

LD PC R 扩±曽 cDNA

⑴ 分 别 取 如 1ul稀释的cDNA 3 份加入PCR管 中 ，补 加 8ul去 离 子 水 将 体 积 调 至 10ul 。

(2)按顺序将以下试剂混合，作为一份主混合物：

去离子水 74ul

IOxAdvantage 2 PCR buffer 10ul

50xdNTP(10 mmol/L) 2ul

PCR 引物(10umol/L) 2ul

50xAdvantage 2 聚合酶混合物 2ul

总体积 90ul

⑶ 向 每 个 P C R 反 应 管 中 加 入 9 0 ul主混合物，按以下参数开始P C R 循 环 ： 95℃5 min; (95℃；、 5s ， 65℃ 、 5s ， 68℃；、 6 min)x l7 循 环 。

⑷ 向 母 个 反 应 管 中 加 入 2ul 0.5mol/L EDTA终 止 反 应 储 存 干 -20℃

P C R 产物的纯化(P C R 纯化试剂盒）

(1) 向 1.5 ml E p 管 中 加 入 100ul 直 接 纯 化 buffer，然 后 加 入 p c R 产 物 ，涡 旋 混 匀 ；

(2) 将 小 柱 子 和 针 管 组 装 在 一 起 ，然 后 加 入 以 上 混 合 物 ，用 注 射 器 针 芯 正 压 缓 慢冲 下 ；

( 3 ) 用 2 ml 80% 异 丙 醇 洗 柱 子 ，用 注 射 器 针芯正压缓慢冲下；

⑷ 移 去 针 管 ，将 小 柱 子 放 置 于 一 个 1.5 ml E p 管 上 ， 10 〇〇〇r/m in离 心 2m in以去除任 何 残 余 的 洗 柱 液 ；

(5) 将 小 柱 子 移 至 一 新 的 1.5 ml E p 管 上 ，加 入 5 0 0 预 热 至 6 5 ℃的 灭 菌 水 ，放 置 Imin后 ，室 温 下 10 000r/min离 心 20s ，洗 脱 DNA即可用于酶切。

从 两 管 中 各 取 出 6ul置 于 另 一 干 净 离 心 管 中 ， -20℃保 存 ，用 于 Rsa I 酶切后电泳分析 所 合 成 的 双 链 cDNA产物的大小和产量。

SSH 法 构 建 Lin^—C D 34⁺细胞 的 cD N A 消 减 文 库 (PC R -Select™ cD N A消 减 试 刻 盒）

在 利 用 SSH 方 法 构 建 Lin^-CD34
^-细 胞 与 Lin^-CD34⁺细 胞 的 cD N A 消 减 文 库 实 验 中 ，以 Lin^-CD34
^- 细胞 cDNA 作 为 检 测 方 (tester)， Lin^-CD34⁺细胞 cDNA 为 驱 动 方(driver)，这 样 获 得 的 即 为 Lin^-CD34^-细 胞 特 异 表 达 或 高 表 达 ，而 Lin^-CD34⁺细胞不表达或低表达的 基 因 。

Rsa I 酶切

⑴ 分 别 用 I 酶 切 检 测 方 及 驱 动 方cDNA以产生大小合适的平头末端的cDNA片段 。反 应 体 系 ：

dsDNA 43.5ul

IOxRas I buffer 5.0ul

RsaI(10U/ul) 1.5ul

总体积 50.0ul

(2) 混匀后稍微离心，置 37℃ 孵 育 2 h 。

(3) 取 5 ul 酶切产物和2 . 5 ul 冻存的未酶切双链c D N A 并排在一 1.0% 的琼脂糖/EtBr凝胶上电泳(I x T A E 电泳缓冲液)，根 据 c D N A 片段大小分布判断酶切效率。

(4) 鉴定酶切完全后，向反应体系中加入2.5ul 20xEDTA/糖原混合物终止反应。

(5)向 管 中 加 入 5 0 ul 酚 ：氯 仿 ：异戊醇(25 : 24 : 1)，充分振荡混匀后，室温、 I4 000 r/m i n 离 心 IOmin，分离各相。

(6) 小心将上层水相移至另一新的E p 管 中 ，废弃中间蛋白层及下层有机相。

(7 向上层水相中加人50ul氯 仿 ：异戊醇(24 : 1)， 振荡混匀，室温、 14 000r/m i n 离心 lOmin，分离各相后再将上层水相移至另一干净的E p 管中。

(8) 加 入 25ul 4mol/L NH4OAc和 1 8 7 . 5ul 9 5 % 乙醇，充分振荡混匀后，室温、 14 000r/m i n 离 心 20 min，小心弃去上清。

(9) 8 0 % 乙 醇 200ul洗漆沉淀， 14 000r/m i n 离 心 lOmin，小心弃去上清。

(10) 空气干燥沉淀，并将沉淀溶于5.5ul无菌水中， -20℃ 保存。

检测方双链CDNA两端接头的连接

(I) Lin^-CD34^- 细胞(作为检测方)双 链 c D N A 经 沿 Ras I 酶 切 后 ，在两端连接相应的接 头 ：

从以上酶切后的检测方cDNA中 取 出 lul，用 5ul无 菌 H 2O 稀 释 ，均 分 成 2 等份，分 别 与 接 头 1 和 接 头 2R 连接，反应体系如下：

分别从检测方1-1和 检 测 方 1-2中各吸取2ul , 共同置于一新的微量离心管中，作为未消减的检测方对照1-c。混勻后稍微离心， 1 6 ℃ 水浴过夜。加 入 1 ulE D T A /糖原混合物终止连接反应，于 7 2℃ 加热样品5m i n 灭活连接酶，样品储存于-20℃ 备用。

(2)接头连接效率分析：为保证后续实验的顺利进行，至 少 需 要 有 2 5 % 的检测方双链 c D N A 连有接头，因此需进行接头连接效率分析。接头连接效率分析采用的是P C R方法。

取分别连有接头1 和 接 头 2R 的检测方c D N A 各 1 ul ，用无菌水稀释至2 0 0 ul ，配制接头连接效率分析P C R 反应体系：

混勻后短暂离心，放 入 P C R 仪 中 7 5℃ 孵 育 5m i n 以补平接头，随后立即开始P C R反应，条件如下： 9 4 ℃ 、 30s; ( 9 4 ℃ 、 10s， 6 5 ℃ 、 30s， 7 2 ℃ 、 2.5 min)x20 循环。取 P C R产 物 5ul 经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳分析扩增片段大小。结 果 应 为 管 1 和 管 2 , 管 3 和 管 4中产物的电泳条带强弱基本一样，它们之间的强度之差应小于4 倍(图6.6)，这种结果说明至少有2 5 % 的检测方c D N A 连上了相应的接头。

将 微 量 移 液 器 设 在 1 5ul , 在含有杂交样品2 的离心管中轻轻将移液器吸头触及矿物油/样品的交界处，小心将所有的样品吸入吸头，然后移开吸头并吸入少量的空气，在样品的小滴下制造一小段空气空间; 随即在含有新鲜变性驱动方的离心管中重复相同的操作，此时吸头应该含有被一小块空气隔开的两种样品，最后将全部的混合物移入含有杂交样品 1 的试管中，上下吹吸混勻。

(5) 混匀并短暂离心后，置 于 68℃ 温育过夜。

(6) 最 后 加 入 200ul以稀释 buffer(20 mmol/L Hepes-HCl， p H 8.3; 50 mmol/L NaCl;0.2 mmol/L E D T A ， p H 8.0)，混匀 ，再将样品置于68T 加 热 7 min，即可作为第一次P C R反应的模板。储存于- 2 0℃备用。

P C R 扩增反应

1 ) 第 一 轮 P C R 扩增

第 一 轮 P C R 反应体系:

无菌水 19.5ul

I O x P C R 反应缓冲液 2.5ul

d N T P 混合物(每种lOmmol/L ) 0.5ul

P C R 引物 1(10umol/L ) 1.0ul

50xAdvantage 2 聚合酶混合物 0.5ul

模板 1ul

总体积 25.0ul

混匀后短暂离心，并 滴 加 5 0 ul 的矿物油覆盖反应物， 于 P C R 仪 中 7 5 ℃ 延 伸 5 min补平接头，随即按下述条件开始P C R 反应： 94℃预 变 性 25s，（94℃、 30s， 64℃ 、 30s，
72℃ ：、 90s)x3 0 循 环 ， 7 2 ℃延 伸 lOmin。 P C R 引 物 1 为 接 头 1 和 接 头 2R 5端共同寡核苷酸序列。

2 ) 第 二 轮 P C R 扩增

将第一轮P C R 产 物 稀 释 10倍 后 ，取 1ul 作为模板，利用巢式引物进行第二次P C R扩 增 ，反应体系如下：

无菌水 18.5ul

I O x P C R 反应缓冲液 2.5ul

巢式 P C R 引物 l(l〇 umol/L ) 1ul

巢 式 P C R 引 物 2R (10 umol/L ) 1.0ul

d N T P 混合物(每种l〇m m 〇l /L ) 0.5ul

50xAdvantage 2 聚合酶混合物 0.5ul

模板 1.0ul

总体积 25.0ul

反 应 条 件 ：（94℃、 30s， 6 8 ℃ 、 30s， 7 2℃ 、 90s)xl5 循 环 ， 72℃、 lOmin。

3) PCR产物的电泳分析

从第一次和第二次PCR产物中各吸取8 ul 于 2% 的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察扩增产物的大小分布。利用巢式引物进行二次PCR扩增后，消减后的样品为夹杂有明显扩增条带的弥散条带，保证了消减杂交产物的质量。

消减效率的P C R 分析

利 用 PCR扩增的方法，通过比较持家基因在消减前后丰度的差别来分析消减效率这里所采用的是持家基因

⑴ 将 消 减 和 未 消 减 (未消减的检测方对照1-c)的二 次 P C R 产 物 1 0 倍稀释于水中，确保消减和未消减PCR产物的浓度大致相等；

(2)以所示的顺序在一支〇.2m l 微量离心管中混合以下试剂：

振荡混勻后短暂离心，并滴加一滴矿物油覆盖反应物；

⑶ 将 其 置 于 P C R 仪中按照下面的程序进行18个循环： 94℃ 、 30s， 6 0℃ 、 30s， 6 8 ℃、2 min；

(4)从每个反应中吸取5ul，并置于另一干净的E p 管 中 ，将反应的剩余部分放回P C R仪中再进行5 个循环；

(5) 重 复 以 上 步 骤 2 次(即在2 8 和 3 3 个循环后各吸取5ul);

(6) 在 2.0% 的琼脂糖凝胶上同时检测在18、 23、 2 8 和 33 个循环时从每个反应中所吸 取 的 5ul样 品 ，观 察 G3PDH的特异性扩增情况。结果 见 图 6.7。

经两轮消减杂交后G 3P D H 在 33 个循环后方可扩增出来，而未经消减的对照则在18个循环时便可见到明显的特异性扩增带，说明经过两轮杂交和两次抑制P C R 已经使持家基因被有效地消减下去，而差异基因得到了富集。

消 减 后 P C R 产 物 的 克 隆

经 2 次 P C R 扩增的消减产物，用于回收构建文库。

P C R 产物的回收(D N A 快速纯化回收试剂盒）

(1) 从琼脂糖凝胶上切下目的条带放入1.5 ml E p 管 中 ，用 一 个 Tip头 捣 碎 ，动作轻 柔 ；

(2) 准确估计凝胶的体积，加 入 3 倍体积的溶胶液，室温放置5 min或 5 0 ℃ 保 温 3 min，其间轻摇E p 管几次使胶完全溶化；

(3)涡旋混匀玻璃奶，向 溶 胶 中 加 人 10ul 颠 倒 混 勻 ，冰 浴 IOmin, 并且 间 隔 2——3 min颠倒混勻一次， 12 000r/m i n 离 心 30s，吸弃上清；

(4)将浓缩漂洗液按3 : 7 与无水乙醇配成工作液，然后向玻璃奶中加入2 5 0 ul ，用加样器吸漂洗液轻柔地将玻璃奶冲散混勻， 12 OOOr/m i n 离 心 30s，吸弃上清；

(5)重 复 第 (4)步一次。吸取完漂洗液后再离心10s，用 Tip头将最后一点儿漂洗液吸干 净 ，然后放置于37℃ 温箱中干燥20 min;

(6)加 2 0 ul Millipore H2O , 用 Tip头轻轻混匀，6 0 ℃ 水 浴 5 min，12 OOOr/min离心 lmin，回收上清即为纯化的P C R 片段。 - 2 0 ℃ 储存。

P C R 产 物 与T 载体的连接
为了产生可被限制性内切核酶酶识别的酶切位点，同时方便测序，首先将回收的PCR产 物 与 T 载体连接。连接采用pGEM®-T Easy Vector System。

连接体系:

2x快速连接buffer 5.0ul

pGEM®-TEasy 载体 1.0ul

P C R 回收产物 3.0ul

T4 DNA 连接酶(3weiss 单位/ul) 1.0ul

总体积 10.ul

4 ℃过夜。

连接产物的转化

参照基因的重组连接

转化重组子的鉴定

1) α 互 补 现 象 的 检 查

将长有菌落的L B 平 板 于 4 放 置 2 h ，使表达有半乳糖苷酶的菌落充分显色。观察菌落的着色情况，蓝色表明为非重组子，白色则为重组子，用无菌牙签分别挑取白色菌落 ，接 种 于 5m l 含有氨苄的L B 液体培养基中， 37℃振 摇 培 养 过 夜 ， 3 0 % 甘油冻存。

2 ) 重 组 子 中 克 隆 片 段 的 P C R 扩增

挑取白色菌落利用两端接头上的巢式引物进行PCR扩增，观察是否有片段插入以及插入片段的大小。

(1) 首 先 在 0.2ml微量离心管中配制PCR反应体系：

IOxPCR 反应 buffer 2.5ul

dNTP 混合物(2.5 mmol/L) 2.0ul

上游巢式引物 0.5ul

下游巢式引物 0.5ul

无菌水 17.5ul

总体积 23.0ul

⑵用吸头蘸取部分菌落，在上面配制的P C R 体系中搅拌均匀，置 P C R 仪上， 95℃ ：加 热 5m i n 裂解细菌；

(3)补 加 Taq D N A 聚合酶(0.3U /ul)2ul后 ，进 行 P C R 循 环 ，循环参数为：（95℃ 、 30s，68℃、 30s， 72℃ ：、 2 min)x30 循 环 ， 72℃延伸 7 min;

从 PC R 产 物 中 取 5ul于 1.0% 的琼脂糖凝胶上电泳，观察特异性扩增片段的有无及大小。