细 胞 周 期 的 检 测

细 胞 周 期 的 检 测 (Pagano et al.2000)

细 胞 计 数

1 ) 试剂

0.25% 胰蛋白酶溶液、无血清培养液。

2 ) 设备

显微镜、计数板。

3 ) 操作规程

(1) 准备计数板：用乙醇清洁计数板和专用盖玻片，用绸布轻轻擦干。

⑵制备细胞悬液：制备单个细胞悬液。本法要求细胞密度不低于 IO⁴ 个/ml。如果细胞数很少，应将悬液离心，重悬浮于少量培养液中。

(3) 加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板盖玻片的一侧加微量细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。

⑷ 计 数 ：在显微镜下，用 IOx 物镜观察计数板四角大方格中的细胞数。细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。
计算：细胞数/毫升原液=(4 大格细胞数之和/4)xl 〇⁴ x 稀释倍数。

4 ) 注意事项

⑴消化单层贴壁细胞，要分散良好。

(2) 取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时尤其要注意这一点。镜下计数时，遇见 2 个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如细胞团占 K )%以上，说明消化不充分，或细胞数少于 200 个/I O m m ² 或多于 500 个/I O m m ² 时，说明稀
释不当，需要重新制备细胞悬液。

5 ) 结果判读

一般根据计数结果能够绘制出细胞的生长曲线，从而算出倍增时间。值得注意的是，倍增时间只能反映细胞周期，但是并不等同于细胞周期。

细 胞 生 长 曲 线

1 ) 原理

只有生长稳定的细胞才能绘制细胞生长曲线 (司徒镇强等 1996)。此处介绍用 MTT 法来进行生长曲线测定的方法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的 M T T 还原为难溶性的蓝紫色结晶物(formazan) 并沉积在细胞中，而死细胞则无此功能。 DMSO 能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在 490n m 波长测定其 OD值 ，可以间接反映活细胞数量。在一定范围内， MTT 结晶物形成的量和细胞数成正比。此方法灵敏度高、重复性好、操作简单且没有放射性污染。

2 ) 试剂

(1) M T T 溶液: 称取 250mg M T T ，加人 50 ml P B S (0.01mol/L ，p H 7. 4)，磁力搅拌 3 〇 min，
用 0.22 um的滤器除菌，分装，代 保 存 。 2 周内有效。
(2) 含 10% 胎牛血清的 R P M I 1640 培养液、 0.25% 胰蛋白酶、 D M S O 。

3 ) 设备

显微镜、振荡仪、酶联免疫检测仪、 96 孔培养板、移濟器、吸管、离心管。

4 ) 操作规程

(1) 接种细胞、培养细胞。

(2) 呈 色 ：培 养 3〜 5 天后，每孔加入 M T T 溶液 (5m g /ml)20ul， 3 7 ℃ 继续孵育 4 h ，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。对于悬浮培养的细胞，需要离心、弃去孔内培养液。每孔加入 150ul D M S O , 振 荡 lOmin，使结晶物充分溶解。

(3) 比色、记录结果。以时间为横轴、光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。

5 ) 注意事项

(1) 选择适当的细胞接种浓度。在进行 MTT 试验前，对细胞要测定其贴壁率、倍增时间和不同接种细胞数时的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止时不致细胞过满。这样才能保证 M T T 结晶形成的量与细胞数呈良好的线性关系。

(2) 避免血清干扰。 一 般选择小于 10% 胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余的培养液。

(3) 设定空白对照。与试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔，其他试验步骤保持一致。最后呈色时，以空白孔为零。

6 ) 结果判读
细胞周期与细胞群体倍增时间是不同的概念。倍增时间是指在对数生长期细胞数量 增 加 1 倍所用的时间，这一时间内一般有些细胞参与分裂，有些细胞可能不分裂，有些可能分裂两次或数次，但是细胞总数增加 1 倍。一般来说，细胞周期短于细胞倍增时间。

流 式 细 胞 术

原理

流式细胞仪能够分析细胞或颗粒物的各种参数，如 DNA、 RNA、 蛋白质含量及这些物质在细胞周期中的变化。用 D N A 直方图可以得网细胞周期中各时相细胞的百分比及 D N A 含量。 G ₀ /G₁ 期细胞 的 D N A 含量是 2n ， G ₂/M 期细胞的 D N A 含量是 4n ， S 期细胞的 D N A 含量介于 2n 和4n 之间。

在细胞周期中用 PI 单独染色无法将 G₀、 G₁期细胞分开，可 以 用 DNA/RNA 双染色将两者分开，这是因为 G₀期细胞不合成 RNA。

流式细胞仪还能够定量细胞总蛋白、定量细胞特定功能蛋白、定量细胞内钙离子等，结合细胞周期的检测，可以观察这些物质在细胞周期中的变化

操作规程

1 ) 制备单个细胞悬液

⑴悬浮生长细胞。用 P B S 洗漆、配制成 IxlO⁶〜 2xl 〇 ⁶个/m l 的细胞悬液备用。

(2) 单层培养的细胞。通常采用酶消化法分散细胞，制成单个细胞悬液，备用。

(3) 实体组织可采用机械法、化学法、酶消化法分散组织细胞。通常是联合应用。细胞悬液用 P B S 洗涤，备用。

2 ) 样品固定
除了分选活细胞或分析活细胞外，都应该固定细胞。
⑴ 甲 醛 法 ：在细胞悬液中，加人等体积的 8 % 甲醛-盐水 G ，代 固 定 12〜 18 h。 常用于 Fuelgen 染色。

⑵ 乙 醇 法 ：细胞悬液离心，弃上清，用 5m l 4℃ 预 冷 的 盐 水 G 重悬，缓慢加入-20℃ 的 9 5 % 乙 醇 15m l ，使其终浓度为 7 0 % ，冰 浴 30 min。常 用 于 Hoechst、 溴化乙键、碘化丙锭 (PI)、异硫氰酸荧光素等染色。

(3) 丙酮法：用生理盐水悬浮细胞，加入冷丙酮，使其终浓度为 8 5 % 。常用于免疫荧光染色。

盐水 G 的配制：葡萄糖 1.lg、 NaCl 8 g 、 KCl 0.4 g 、 Na2 H P O 4 • 12 H 20 0.39 g 、 K H 2P 〇 4 0.15 g ，加 蒸 馏 水 至 1L 。待完全溶解后，称 取 M g S O 4 J H 2O L 54 g 、 C a Cl2. H 2O 0. 16 g ，依次溶解于上述 I L 盐溶液中。

3 ) 细胞染色

这里仅介绍几种常见的染色。
(1) PI 染 色 。 P I 能嵌人双螺旋之间，不能通过完整的细胞膜。在染活细胞时要将细胞固定或打孔，另外，染 D N A 时需要用 R N A 酶处理细胞。激发波长为 488n m 。

a. P I 15 mg，枸橼酸钠 O.lg ， NP-40 0.3mI，加 蒸 馏水至 100 ml, 4 ℃ 避光保存。

b. 将等体积的单细胞悬液和 PI 染液混合， 4 ℃ 放 置 15——20 min。

c. 测量前将样品用 3 0 0 目尼龙膜过滤。

(2) 光辉霉素 (M I ) 染色。 M I 只 与 D N A 以非共价键结合。激发波长为 488n m 。
a.M I 染液的配制：商品 M I 每支含 M I 2.5m g ，用 15 mmol/L M g C l 2 及 150 mmol/L N a C l 溶 液 将 M I 配 制 成 100pg/m l 溶液， 4 ℃ 避光保存。

b. 制备单细胞悬液：活细胞悬浮于含有 5%——10% 胎牛血清的培养液中；经 7 0 % 乙醇固定的死细胞悬浮于生理盐水。细胞密度为 IO⁵ 〜 IO⁷ 个/ml。

c. 将细胞悬液与等体积的 M I 染液混合，室 温 染 15——20 min。

d测量前将样品用 3 0 0 目尼龙膜过滤。

<3) D N A 和 R N A 双重染色。
a. 制备活细胞悬液，悬浮于培养液或 P B S 中；用 蒸 馏 水 溶 解 Hoechst33258, 用P B S 稀 释 成 lmmolTL 的储存液，代 避 光 保 存 。

b.将 5 UMol/L 的 Hoechst33258 染液与等体积细胞悬液混合，37℃ ，避 光 60〜 90 min。

c. 继 续 加 人 5umol/L 的 P Y 染 液 ， 37℃静 置 45 min。

d. IOOOg 离 心 lmin，除去染液，用 RPMI1640 培养液悬浮细胞。

e. 用紫外光 (351〜 363n m ) 激 发 Hoechst33258 测 定 D N A ，用 476n m 波长激发 P Y 测定 R N A 。

4 ) 注意事项

⑴ 在 制 备 样 品 时 ，离心次数不要过多，防止细胞丢失或凝集成块。

(2) 消化细胞时应该注意各种不利因素，注意酶的浓度和活性。

(3) 细胞固定时间不能过长。不要使用冰醋酸-乙醇、苦味酸及含汞固定剂。

(4) 调 试 F C M 时 ，应使用理想的标准品，以便获得较高的分辨率。

分 离 、检 测 处 于 不 同 时 相 的 细 胞

离心淘洗法

1 ) 原理
有些细胞』处于不同时相时的体积和重量会有明显差别，可以通过密度梯度离心来分离。该方法操作简单、省 时 ，得到的细胞群体均一性较好，成本低，并且不扰乱细胞生长。但 是 ，对于多数种类的细胞并不适用。

2 ) 操作规程
(1) 细胞培养⑵淘洗前将处于对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化，并 重 悬 于 20m l(5 ml 分离室)或 100 ml(5 〇 m I 分离室) 冷的组织培养液中。

(3) 分 离 所 需 的 最 佳 细 胞 数 ， 5 ml 分 离 室 为 4xl 〇 ⁷〜 6xl0⁷ 个 细 胞 ， 50m l 分离室为
4XlO⁸〜 6xl 〇 ⁸ 个细胞。

(4) 这里给出分离 CHO 细胞的步骤：

a用冰浴冷却的含血清的完全培养基淘洗 (血清含量根据细胞类型的不同来决定)。

b. 调转速和流速，使细胞停留在分离室。

c. 借助泵的作用加入样本，不要使标本进入气泡清除室。

d. 加样后即开始收集每一个转速下洗脱出的液体，转速的增加要使各组分洗出细胞的体积稳步增加。
e. 分离过程中，每一流分细胞数、细胞体积均需检测。

f.对每一流分，从体积分布以校准常数求出中位数体积。校准常数由统一大小和密度的乳胶颗粒推导出。

g.以体积中位数为基准，选择处于不同时相的细胞以备进—步研究。每一流分的均一性都用流式细胞仪来评估。

3 ) 注意事项
淘洗系统应在实验前 12〜 24 h 内消毒，以免细菌或酵母污染。

M 期细胞振荡脱落法
1 ) 原理
单层生长细胞在 M 期变圆，对瓶壁的锚着减弱，易于游离到悬浮液中。该方法不干扰细胞生长，但是分离的细胞数少且只能用于贴壁生长的细胞。

2 ) 操作规程
轻轻摇动或在边台上叩击培养瓶。使培养液冲刷瓶壁，然后吸出培养液以收集頁期M胞 。从 各 培 麵 中 收 集 培 养 液 、集中、离 心 ，使 皿 期 细 臓 积 林 。细 胞 重 悬 用 流式细胞仪来评估均一性，供进一步的分析。

药物诱导同步化——同步化在 G 0/G1 期

1 ) 原理

血清撤离可以使细胞停滞在 G0 期 ，添加后重新进人细胞周期。

2 ) 操作规程
⑴ 以 汇 合 密 度 的 3 〇% 重悬细胞、培养，血清浓度依细胞种类的不同选定，一般是0—— 0 . 5 %

(2) 血清饥饿 24〜 48 h 后 ，细胞进人 G0 期样的状态
。
⑶ 重 悬 细 胞 ，用含血清培养基培养，细胞将重新进入细胞周期不同时间取样流式细朦 评 估 均 —性

3 ) 注意事项

⑴ 首 先 蔚 請 楚 雛 生 长 細 麵 倍 獅 间 雜 可 麵 的 汇 合 優 大 细 胞

(2) 血清撤出需要掌握最佳的撤除量及撤除时间

(3) 有些细胞不适合用血清饥饿法。 °

药物诱导同步化一 同步化在 G 1 期早期

1 ) 原理

Lovastatin 抑 制 HMG-CoA 还原酶，可使细胞停滞在极早的 G1 期。

2 ) 试剂

用 9 5 % 乙醇稀释 Lovastatin 到 50m g /m l ，溶 液 中 加 入 lm ol/L 的 NaOH 调 高 pH，再用 lm ol/L 的 H C l 中和。活化后用无菌去离子水稀释至 10 mm 〇 l/L ， -20℃储存备用。

3 ) 操作规程

(1) 以最大细胞密度的 3 0 % 培养细胞，培养液中加入 Lovastatin。浓度依照细胞种类的不同而调整，一般 是 10〜 60umol/L 。

(2) 用 PB S 洗 2 次以解除 Lovastatin 的作用，然后用含有甲经戊酸的培养基培养，密 度 是 汇 合 密 度 的 30%——40%。甲轻戊酸的浓度应在所用 Lovastatin 浓度的 1 〇〇倍以上。

4 ) 注意事项
很多细胞经 Lovastatin 处理后，在恢复中 G1 期被延长了。

药物诱导同步化一 同步化在 G 1 期晚期

1 ) 原理

Mimosine 是从植物中获得的，能将细胞阻滞在 G1 期晚期。

2 ) 试剂
Mimosine 用P B S 溶 解 ，终 浓 度 是 100 mmol/L ， 4 ℃储存备用。

3 ) 操作规程

(1) 指数生长期细胞在含 1 〇〇 〜400^imol/LMimosine 的培养液终，培 养 16——24 h。

(2) 用 PBS 洗 2 次 ，解 除 Mimosine 的阻滞作用，以汇合密度的 3 0 % 〜 4 0 % 重悬于培养液中，继续培养。

药物诱导同步化—同步化在 G 1/ S 期交界点

1 ) 原理
T d R 是 D N A 合成抑制剂，加 人 T d R 后一段时间，所有细胞将处于 S 期 ，但是可能处 于 S 期的任何时期。

2 ) 操作规程

(1) 用 P B S 将 T d R 稀 释 ，过滤除菌， -2O ℃ 储存备用。

⑵ 将 指 数 生 长 期 细 胞 用 含 有 2 mmol/L T dR 的新鲜培养液培养 (TG 2+TM +TGl)， 此时细胞位于 G 1A 期交界点和 S 期的任何时期。

(3) 用 P B S 洗 2 次 ，解 除 T d R 的抑制作用。用新鲜培养液培养一段时间 (要 小 于 t G1)，使得原来处于 S 期末的细胞没有进入 S 期 ，原来处于 G 1A 期交界点的细胞离开 s 期 。

⑷ 再 次 进 行 TdR 抑 制 ， l 2——l4 h。 这时所有细胞都处于 G1A 期交界点。取 样 ，用流式细胞仪评估细胞周期时相。

(5) 除去二次 T d R 的抑制作用，释放后不同时间取样，可以获得需要的、位于不同时相的细胞，用流式细胞仪评估后，可供进一步检测。

3 ) 注意事项
这是应用最广泛、也是最被认可的细胞周期同步化技术。第一次的释放时间长短是至关重要的。

M 期细胞同步化

1 ) 原理
用秋水仙素、秋水仙胺或 nocodazole 等 ，能抑制细胞分裂，将细胞阻断在 M 期 。该法常常与 M 期细胞振荡脱落法联合应用。

2 ) 注意事项

(1) 由于该方法常常造成细胞的不可逆变化，所以此方法有一定争议。

(2) 药物浓度、作用时间都需要摸索