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改进方法

相关实验:MALDl-MS 实验

最新修订时间:

原理

MALDI离子化过程本身存在一个问题即离子化过程中动能有微小的分散。由单个激光脉冲产生的离子的动能的微小差别削弱了 MALDI-MS 的分辨力。多肽的质量分辨率(m/Δm) 通常为 40-800 FWHM (峰高一半处的峰宽),蛋白质的质量分辨率通常为 50-400 FWHM, 这样的质量分辨率即使是多肽的同位素分布也不能确定 初始能量的分散是与质量有关的,离子质量越大,峰越宽。现已发展了两种技术以提高MALDI-MS 的质量分辨率.使用离子镜 (iron mirror) / (反射器 reflection) 和(或)采用时间延迟聚焦 (time-lag-focusing) 处理(图 5.lb 和 5.k) 。如图, 离子镜/反射器在一个特定区域内将离子反射回检测器。

材料与仪器

蛋白样品
基质
MALDI-MS

步骤

通过以下步骤实现:在飞行器未端放置的反射器上施加高电压,其电压值比离子源的电压值稍高,进入反射器的离子在电场作用下方向偏转,直至停止飞行,然后在反射器内被赋新加速飞出反射器进入第二检测器(Ill 5. lb) 。反射器充当了一个能量聚焦装置,因为动能稍小的离子(速度慢),进入反射器的距离短,折返也较早,动能稍大的离子进入反射甜的距离长,折返较晚,所以速度慢的离子赶上速度快的离子,反射器的应用减少了离子初始动能的分散,因此提高了质量分辩率,第二种用来修止 MALDI 离子化过程中初始能景分散的技术是在离子源内实现的,由 Wiley 和 McLacen 在 1953 年提出, 称为时间延迟聚焦, 最近被称为延迟提取 (delayed extraction)在图 5. lb 和 c 中村到,相对于连续离于提取(图 5, la), 延迟提取是在样品靶和接地的连续离子提取透镜之间又加了二级离子透镜(施加电压),延迟提取时,MALDI 在无电场区域产生离子,在施加提取电压使离子加速进入飞行管道之前,离子可以四处分散今这样显著降低了离子的能低分散,同时也限制了峰的展宽,峰的展宽通常是由于在连续离子提取模式下源内离子碰撞产生不稳定的解离所致也延迟提取使线性 MALDI 质谱仪分析多肽的质量分辨率达到 2000-4000, 便反射 MALDI 质谱仪分析多肽的质量分辨率达到 3000-6000 。



PSD-MALDI-MS 为了在MALDI-MS仪器上获取一级结构信包,必须选择分析某一离子及其碎片离子的质量 这一过程发生在源内离子化之后,所以被称为源后衰变 (post source decay, PSD) 。对多肽进行 PSD 分析时,其碎片离子主要是沿多肽骨架断裂形成,产生的一系列碎片离子在理论上包含若这-肽段的氨基序列信息,离子源内产生的离子被加速后在飞行过程中产生的碎片离子是亚稳离子, 所有的碎片离子都具有与其前体离子相同的速度,但只具有前体离子动能的一部分分。所有的离子, 包括前体离子和碎片离子,由于具有相同的表观质荷比,都将在同一时间到达线性检测器,所以在线性 TOF 分析器中,不能分辨碎片离子与前体离子但是使用离了镜(反射器)可以分辨碎片离子与前体离子的动能差异,现在有两种反射器 双程 (dual-stage) 反射器和环场 (curved-field) 反射器,双程反射器只能在有限的动能范围内聚焦离子,为了使较宽动能范围的离子都被聚集,反射器电压要逐步减少,连续降 7 -14 步,聚焦动能越来越小的离子,收集到最后一张谱图时,反射器电压大致是初始电压的 5% -10% 。由数据系统整合出连续完整的碎片离子谱图,并根据每一反射电压下的碎片离子校正谱图进行校正,环场反射器能在一次试验中分辨出所有的碎片离子。环场反射器是由一系列电压逐渐减小的离子透镜组成的长反射器(图 5.k), 因此聚焦不同质荷比的碎片离子所需的电压一直存在,但是在空间上是可以分辨的。在同,激光脉冲下如果产生多个肽段离子,在没有质量过滤器时,不能区分不同肽段产生的碎片离子,也不能区分碎片离了与未断裂的肽段离子。因此,装备有以上任一种反射器的质谱仪都安装了一个离子门 (ion gate), 可以在低分辨率情况下(± 2.5%) (图 5, lb 、 c) 选择前体离子/碎片离子。所以,在一个未经分离的肽混合物中,可以选择多个肽段得到其序列特异的碎片离子信息。

来源:丁香实验

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