ENU 是一种烷化剂，它能在 DNA 上将乙基传递给氧或氮基，导致碱基错配或替换（主要诱发点突变，即在 A-T 碱基对替换）。ENU 已被成功地用于获取单基因的各种等位基因。这些措施包括等位基因功能，亚效等位基因功能的缺失，并获得功能突变。在单个位点等位基因系列进一步确定基因功能上是非常强大的。此外，表型驱动的 ENU 筛选提供了解析发育和生化途径的工具。

器材：

①一次性无菌手套；35-，60-，100-，和 150-mm 细胞培养皿；一次性移液管；15 mL Falcon 离心管；冻存管；

②手术钳

③注射器、移液枪、枪头等

④PCR 仪、水浴锅、离心机等

⑤电泳仪、电转仪

试剂：

①材料：小鼠

②促性腺激素

③DNA 聚合酶、限制性内切酶、连接酶、胰酶等

④琼脂糖、电泳缓冲液、重悬液

⑤X-gal

⑥PBS、TRizol、氯仿、异丙醇

⑦RACE 试剂盒

基因捕获技术的基本过程可分为如下几步：

一、基于整体小鼠水平的 ENU 化学诱变及突变小鼠的筛选

（一）ENU 的准备

在通风橱中称量 ENU，称量 100 mg ENU 于 15 mL Falcon 离心管中，再加入 10 mL 冰冷的 Soerensen 缓冲液，制备成 10 mL 10 mg／ml ENU 溶液（注意 ENU 的稳定性是 pH 依赖性的）。通过剧烈振动溶解 ENU，正常情况的溶液为亮黄色，否则试剂将不能使用。ENU 的浓度可以用 398 入分光光度计确定，使用公式 ［ENU］＝（OD1／0.72）计算 ENU 的浓度。而注射时的体积计算公式为 VENU（mL）＝（剂量／［ENU］ 体重（g））。ENU 剂量的范围为 200～400 mg，单次处理时最大剂量为 200～250 mg，多次处理时最大剂量为每次 100 mg，最多 4 次（即 400 mg）。如果要进行 06-BG 处理，用 DMSO 溶解 06-BG，并用 ES 细胞培养基稀释到 10 μmol／L 与适当浓度的 ENU 一起使用，过滤灭菌后应立即使用。

（二）突变小鼠制备

1．小鼠的饲养和品系

（1）SPF 环境：小鼠最优的进行突变的实验环境是无特定病原体环境（specific pathogen-free，SPF）。既然 ENU 会使多种干细胞类型缺失，如造血干细胞，这也会由暂时的病原体过敏产生。因此，注射雄性小鼠不仅要经过一段时间的不育，而且它们由于具有比未处理小鼠更高的细菌易感性而导致较早地死亡。

（2）小鼠品系的选择：选择适当的小鼠品系是有效突变筛选的一个重要前提。

2．ENU 注射制备突变小鼠

（1）注射前准备

1）注射期间，需要戴上手套、工作服、护目镜和面具。

2）工作台面准备些碱性溶液（0.1 mol／L NaOH），一旦 ENU 溅落出来，立即用碱液处理，碱液反应几分钟后再将其清理。

（2）注射过程

1）小鼠腹腔注射 0.5 mL 冰冷的 ENU 溶液（浓度根据每组的平均体重而定）。注射过程按照《小鼠胚胎操作》上描述的执行。

2）注射过程需在 ENU 准备 60 分钟内完成。

3）如果有 ENU 剩余，必须用 0.1 mol／L NaOH 立即处理。

4）ENU 注射后，至少要关闭这个间 24 小时以降低接触突变剂的风险。

（3）不育的检测：不育检测中，在最后一次注射 7 周后，每个突变处理雄鼠与一只野生型雌鼠配对，以保证这些突变分析的后代是来自暴露在精原干细胞阶段的细胞衍生而来的。而小鼠精子发生从精原干细胞到成熟精子大概需要 49～51 天。不育周期依赖于生精小管新精原细胞增殖的成功。既然不育周期和突变频率有些相关，注射后 80 天后才能进行完 F1 代的表型分析。

（4）显性突变筛选的小鼠培育

1）小鼠显性突变表型筛选的培育流程如图 5-4-3 所示，基本步骤如下：①可育的突变处理雄鼠经过约 80 天的不育期后，与野生雌鼠配对产生子一代 G1，我们假设他们都是杂合子突变。②每只雄鼠与一组两只（或更多）雌鼠配对，一周后将雄鼠与另一组雌鼠配对，如此循环以加速 G1 代的数量。③每个突变处理小鼠的后代 G1 必须限制在 100 以内，因为小鼠中可能只存活少量的精原干细胞而产生成簇的突变。

2）显性性状的遗传性：①G，中的突变候选小鼠与野生型的小鼠配对产生 G2 代以检测突变表型的可遗传性。②收集 20 个 G2 后，检测感兴趣的表型。这个数量足以保证完全外显显性突变 P＝0.01 有效。③如果子代中有一个表现了突变表型就可以确认这个突变。④通过杂合（＋／-）与原始自交系的远交建立一个显性突变系。既然仅有 50％ 的子代带有突变，表型分析评价要在整个后代中进行。⑤如果两个有表型的杂合子杂交产生出纯合的（-／-或 M／M）小鼠可能为亚显性突变。如果杂合子和纯合子之间存在一个逐渐的表型差异，那么就可以下结论说这是个亚显性性状。

（5）隐性突变筛选小鼠的饲养：隐性突变小鼠饲养流程如图 5-4-3 所示。既然使用 G，雄鼠产生 G3 比用 G，雌鼠快得多，因此我们只讨论这种较快的策略。而有数据表明获得隐性突变小鼠在 P＝0.005 时是有效的。在选择 G，候选突变小鼠建立隐性突变系时需要考虑：①G，雄鼠都被视为杂合子突变，但没有明显的表型；②每个 G，建群者都应来自不同的突变处理雄鼠，以建立广泛变异的隐性表型。

1）隐性遗传雄性 G1 小鼠的繁育策略：①雄性 G1 建群者（＋／-）和一组（4 个）野生型雌鼠杂交产生 G2 后代。这里仅收集雌性 G2（＋／-或＋／＋）。②（8 个）雌性 G2 与 G1 回交产生 40 个 G3 后代，他们将被用于隐性突变的评价。

2）隐性遗传雌性 G1 小鼠的饲养策略：①一个雌性 G1 建群者（＋／-）和一个野生型雄鼠杂交产生 G2 后代（＋／-或＋／＋）。两种性别小鼠都收集。②至少建立 4 组 G2xG2 互交产生 G，后代，要注意的是这里只有 8.3％（1／12）的 G，可能拥有隐性突变表型。

3）隐性遗传表型的遗传性检测。使用以下两步法检测突变表型的遗传性：①G，纯合子（-／-）候选小鼠与野生型（＋／＋）小鼠杂交产生杂合子 G4（＋／-）后代。②建立 2 组 G4 G4 互交产生 G3 后代，至少 20 个 G3 用于表型分析。这个数据对于一个全外显率突变来说，产生 25％ 的预订表型是有效的。③如果这里有一个后代表现了突变表型，则这个突变可以被确认。④通过两个有表型小鼠杂交建立一个新的隐性突变。为了检测隐性突变的可育性，分别用有表型的（-／-）雄鼠和雌性小鼠分别和原先的野生型小鼠杂交。如果它们是纯合子，它们可能发生一种性别是不育的。这时就必须把纯合子（-／-）换为杂合子（＋／-）饲养策略。

（6）遗传作图：已被作图染色体的定位被用来克隆某个基因或检测某些已存在的基因。如果突变等位是完全显性的或突变等位是隐性的但纯合子是能育的，使用回交（backcross）策略较好。如果纯合子个体是不育的且是隐性外显突变，使用互交（intercross）策略较好。最好的连锁分析条件是使用两个不同的拥有高多态性的小鼠品系杂交。连锁分析使用一组用于全基因组微卫星标志遗传作图（www.informatics.jax.org）或最近的使用单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP）遗传作图（www.genome.wi.mit.edu／SNP／mouse／）。

（7）突变数据库的构建

二、基于 ES 细胞的 ENU 小鼠突变技术

（一）ES 细胞的 ENU 突变

1．将 ES 细胞铺在铺有饲养层细胞的 100 mm 细胞培养皿上，37 ℃，5％CO₂ 条件下培养。

2．培养细胞直到细胞达到 80％ 聚合度。

3．将培养基换成 10 μmol／L 06-BG 的 ES 细胞培养基，37 ℃，5％CO₂ 条件下培养 12～16 小时。

4．去掉 ES 细胞培养基，并用 1xPBS 清洗细胞，加入 3 mL 0.05％ 胰酶，37 ℃，5％CO₂ 孵育 10 分钟。

5．轻轻地用移液器吹打细胞，使形成单细胞重悬液。

6．加入 10 mL ES 细胞培养基，700 g 离心 5 分钟。

7．去掉上清用 ES 细胞培养基重悬沉淀，使得细胞浓度到 5x10／mL，加入 10 μmol／L 06-BG 和特定浓度的 ENU（0.5 mg／mL）。

8.37 ℃ 匀速摇晃孵育重悬细胞 1 小时（2 小时）。

9．清洗细胞并细胞计数。细胞最终分成 3 部分：细胞死亡检测，细胞突变率检测，表达和冻存。

（二）ES 细胞死亡的检测

1．接种 1x10 突变剂处理细胞和未处理对照细胞于铺有饲养层细胞 60 mm 培养皿中。

2．按常规培养细胞，1 周后计数细胞克隆总数。

3．比较处理组和对照组，估计细胞存活率。

（三）细胞突变率的检测

1．接种一半突变剂处理过的细胞于 60 mm 培养皿中（不需饲养层）。

2．正常传代培养细胞大约 10 天。

3.1.5 mL 0.05％ 胰酶消化细胞，细胞培养箱中孵育 10 分钟。

4．轻轻吹打细胞成单细胞重悬液。

5．用 ES 细胞培养基清洗细胞，接种 0.5x10°细胞于 4 个 150 mm 培养皿中。加入 6TG 到终浓度 100 μg／mL。3 天后去掉选择培养基，两周后统计克隆数。

6．同时接种 1x10 细胞于 60 mm 培养皿中不加 6TG 处理，培养 1 周后统计克隆数，这些细胞用于确定细胞培养存活率。

7．计算突变率。

（四）突变嵌合体小鼠的制备

（五）突变的筛选

（六）突变基因的定位